【技术实现步骤摘要】
单细胞核酸序列分析
[0001]本申请是申请日为2016年8月26日、国际申请号为PCT/US2016/049046、国家申请号为201680064504.7、专利技术名称为“单细胞核酸序列分析”的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求于2015年8月28日提交的美国临时申请62/211,597的优先权,并且本申请是于2015年4月28日提交的PCT申请PCT/US15/28062的部分继续申请,该PCT申请要求于2014年4月29日提交的美国临时申请号为61/985,983以及于2014年5月1日提交的美国临时申请号为61/987,433的优先权,这些在先提交的申请中的每一件都通过引用的方式以其全部并入本文。
[0004]政府支持
[0005]本专利技术是在公共卫生署(PHS)授予的国家卫生研究院(NIH)基金号为MH098977的政府支持下完成的。政府在本专利技术中具有一定权利。
技术介绍
[0006]对细胞或组织的mRNA含量进行测定(即,“基因表达谱分析”)提供了用于正常及患病组织和器官的功能分析的方法。基因表达谱分析通常通过从组织样品中分离mRNA并且使该mRNA经受微阵列杂交来进行。然而,此类方法仅允许分析先前已知的基因,而不能用于分析选择性剪接、启动子及聚腺苷酸化信号。此外,微阵列具有两个主要缺点:它们与已知基因连接,并且它们具有有限的灵敏度和动态范围。
[0007]对组织的全部或部分mRNA含量进行直接测序被越来越多地采用。然而,目前通过直接测 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种从多个单细胞制备cDNA文库的方法,包括:从每个单细胞中释放mRNA以提供多个单独的mRNA样品,其中每个单独的mRNA样品中的所述mRNA来自单细胞;用第一链合成引物从每个单独的mRNA样品中的所述mRNA合成cDNA的第一链并且将标签并入所述cDNA以提供多个经标记的cDNA样品,其中每个经标记的cDNA样品中的所述cDNA与来自单细胞的mRNA是互补的,并且其中所述标签包括细胞特异性标识符序列、第一读取测序衔接子序列和唯一性分子标识符(UMI)序列;将所述经标记的cDNA样品池化;扩增所池化的cDNA样品以生成池化的经标记的双链cDNA;以及通过使所述池化的经标记的cDNA与多个转座体复合物接触而用转座酶在所述池化的经标记的双链cDNA上进行标签化反应,所述多个转座体复合物中的每个转座体复合物包括与转座子复合的转座酶,所述转座子包括第二读取测序衔接子序列,其中所述第二读取测序衔接子序列不同于所述第一读取测序衔接子序列,以生成所述cDNA文库,其中所述cDNA文库包括多个经标记的cDNA片段,所述多个经标记的cDNA片段具有在第一链上的所述第一读取测序衔接子序列以及在第二链上的所述第二读取测序衔接子序列。2.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括扩增所述cDNA文库的所述经标记的cDNA片段以生成扩增的经标记的cDNA片段。3.如权利要求2所述的方法,其中扩增所述经标记的cDNA片段包括向扩增产物的5
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端添加额外的序列。4.如权利要求3所述的方法,其中所述额外的序列包括引物结合序列,所述引物结合序列用于与固体支持物上的互补的引物结合序列杂交以及在所述固体支持物上扩增所述经标记的cDNA片段。5.如权利要求4所述的方法,所述方法还包括将所述扩增的经标记的cDNA片段与所述固体支持物上的所述互补的引物结合序列杂交,以及在所述固体支持物上扩增所述扩增的经标记的cDNA片段。6.如权利要求5所述的方法,所述方法还包括对在所述固体支持物上的扩增产物进行测序。7.如权利要求1
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6中的任一项所述的方法,其中所述标签化反应包括使所述双链cDNA与包括Tn5转座酶的转座酶混合物接触。8.如权利要求7所述的方法,其中所述多个转座体复合物主要由具有转座子的转座体组成,所述转座子包括所述第二读取测序衔接子序列。9.如权利要求1
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8中的任一项所述的方法,所述方法进一步包括对所述cDNA文库的所述经标记的cDNA片段进行测序。10.如权利要求9所述的方法,其中测序包括3
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标签计数。11.如权利要求9所述的方法,其中测序包括全转录组分析。12.如权利要求1
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11中的任一项所述的方法,其中使用随机引物的混合物进行第一链合成,其中所述随机引物包括所述标签。13.如权利要求1
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12中的任一项所述的方法,其中所述第一链合成引物包含双链部分。14.如权利要求13所述的方法,其中所述第一链合成引物与单链第一链合成引物相比,
减少了串联副产物。15.如权利要求13所述的方法,其中所述第一链合成引物包括能够形成发夹的区域。16.如权利要求13所述的方法,其中所述第一链合成引物包括RNA区域。17.如权利要求13所述的方法,其中将所述第一链合成引物杂交到互补的寡核苷酸,由此形成双链部分。18.如权利要求1
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17中的任一项所述的方法,其中所述第一链合成引物附接到珠粒,并且所述合成包括在所述珠粒上合成经标记的cDNA样品。19.如权利要求18所述的方法,包括在从每个单细胞中释放mRNA之前将每个单细胞封装在具有所述珠粒的小滴中。20.如权利要求19所述的方法,其中所述小滴使用小滴致动器生成。21.如权利要求20所述的方法,其中每个经标记的cDNA样品的释放和合成在所述小滴中进行。22.如权利要求18或21所述的方法,其中将所述经标记的cDNA样品池化包括池化具有附接的经标记的cDNA样品的珠粒。23.如权利要求1
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22中的任一项所述的方法,其中所述第一链合成引物是寡聚dT引物和随机物引物的混合物。24.如权利要求1
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23中的任一项所述的方法,其中从每个单细胞中释放mRNA包括从每个单细胞的细胞核释放mRNA以提供所述多个单独的mRNA样品,其中每个单独的mRNA样品中的mRNA来自单个的细胞核。25.一种从多个单细胞器制备cDNA测序文库的方法,包括:空间上分隔单细胞器;从每个单细胞器中释放mRNA、微RNA、小干扰RNA、核糖体RNA和/或线粒体RNA以提供多个单独的RNA样品,其中每个单独的RNA样品中的RNA来自单细胞器;用第一链合成引物从每个单独的RNA样品中的RNA合成cDNA的第一链,所述第一链合成引物包括标签,由此将所述标签并入所述cDNA以提供多个经标记的cDNA样品,其中每个经标记的cDNA样品中的所述cDNA与来自单细胞器的RNA是互补的,并且其中所述标签包括细胞器特异性标识符序列;将来自所述多个单细胞器的所述经标记的cDNA样品池化;扩增所池化的cDNA样品以生成池化的经标记的双链cDNA样品;以及通过使所述池化的经标记的cDNA与多个转座体复合物接触而在所述池化的经标记的双链cDNA样品上进行标签化反应以同时切割每个cDNA并且将衔接子并入cDNA的每个链中,由此生成来自所述多个单细胞器的cDNA文库。26.如权利要求25所述的方法,其中所述标签还包括唯一性分子标识符(UMI)序列。27.如权利要求25或26所述的方法,其中所述第一链合成引物是寡聚dT引物和随机物引物的混合物。28.如权利要求25
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27中的任一项所述的方法,其中所述标签包括第一读取测序衔接子序列。29.如权利要求28所述的方法,其中:所述多个转座体复合物中的每个转座体复合物包括与转座子复合的转座酶,所述转座
子包括第二读取测序衔接子序列,其中所述第二读取测序衔接子序列不同于所述第一读取测序衔接子序列,以生成所述cDNA文库,其中所述cDNA文库包括多个经标记的cDNA片段,所述多个经标记的cDNA片段具有在第一链上的所述第一读取测序衔接子序列以及在第二链上的所述第二读取测序衔接子序列。30.如权利要求29所述的方法,所述方法还包括扩增所述cDNA文库的所述经标记的cDNA片段以生成扩增的经标记的cDNA片段。31.如权利要求30所述的方法,其中扩增所述cDNA文库的所述经标记的cDNA片段包括向扩增产物的5
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端添加额外的序列。32.如权利要求31所述的方法,其中所述额外的序列包括引物结合序列,所述引物结合序列用于与固体支持物上的互补的引物结合序列杂交以及在所述固体支持物上扩增所述经标记的cDNA片段。33.如权利要求32所述的方法,所述方法还包括将所述扩增的经标记的cDNA片段与所述固体支持物上的所述互补的引物结合序列杂交,以及在所述固体支持物上扩增所述扩增的经标记的cDNA片段。34.如权利要求33所述的方法,所述方法还包括对在所述固体支持物上的扩增产物进行测序。35.如权利要求25
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34中的任一项所述的方法,其中所述标签化反应包括使所述池化的经标记的双链cDNA样品与包括Tn5转座酶的转座酶混合物接触。36.如权利要求35所述的方法,其中所述多个转座体复合物主要由具有转座子的转座体组成,所述转座子包括第二读取测序衔接子序列。37.如权利要求25
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36中的任一项所述的方法,所述方法进一步包括对所述cDNA文库的所述经标记的cDNA片段进行测序。38.如权利要求37所述的方法,其中测序包括3
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标签计数。39.如权利要求37所述的方法,其中测序包括全转录组...
【专利技术属性】
技术研发人员:倪拉吉,
申请(专利权)人:ILLUMINA公司,
类型:发明
国别省市:
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