一种高通量构建RNA测序文库的方法及试剂盒技术

本公开涉及构建测序文库的方法、基因探针组合以及试剂盒。本公开的建库方法可以结合二代测序等测序手段实现超多重数字化基因表达检测，可以同时检测出成百上千(甚至全基因组)的基因表达，特异并且无偏检测样本中基因的表达量。本公开的基因探针组合(靶向探针)可用于直接捕获RNA进行二代测序建库。直接捕获RNA进行二代测序建库。直接捕获RNA进行二代测序建库。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量构建RNA测序文库的方法及试剂盒


[0001]本公开属于分子生物学靶向RNA测序领域。本公开涉及构建测序文库的方法、基因探针组合以及试剂盒。

技术介绍

[0002]基因表达模式对细胞功能有着直接的影响。RNA是基因表达过程的中心纽带，参与了基因表达相关的许多功能过程。鉴定和量化基因表达对理解生物体正常的生理功能，疾病的病理过程十分重要。RNA鉴定和量化基因表达有多种方法，传统上主要基于荧光定量PCR、基因表达芯片和常规RNA
‑
seq(RNA
‑
sequencing)等，近几年又发展了新的方法如NanoString数字式单分子基因表达谱等。技术的发展拓展了不同应用场景。
[0003]常规RNA建库方法包括：1)总RNA提取；2)mRNA分离与片段化；3)cDNA第一链合成；4)cDNA第二链合成；5)双链cDNA的末端修复；6)连接接头；7)PCR富集文库。
[0004]靶向捕获RNA是一种准确高效的RNA富集检测方法，可以针对感兴趣的基因或转录本批量设计探针，是检测基因表达量、基因融合、剪接变异、单核苷酸变异和插入/缺失等的有效方法。例如NanoString的数字基因表达谱技术针对每个mRNA分子设计分子杂交探针(探针的长度约为35
‑
50nt)。针对每个基因或转录本独特区设计的成对探针，报告探针的5
’
端包含一个荧光分子条形码标记，捕获探针的3
’
端含有生物素标记。报告探针和mRNA杂交后形成复合物，经过分离纯化，杂交产物固定于样品板上。进而由数字分析仪对每个样本的荧光分子条形码进行识别、扫描和计数，解析出样本中基因表达量。
[0005]美国专利US9938566报道了一种基于探针靶向捕获法检测基因表达量的方法。该方法的特点是，对检测基因设计了一对探针，探针包含基因互配的区域和通用接头区域。探针与靶向模板互配，连接酶将成对互配探针连接成完整片段，随后通过通用接头区域PCR扩增，解析出样本中基因表达量。此方法成功检测出样本中基因表达量与基因突变。但该方法的问题在于检测通量低，连接探针通过PCR信号放大后未修正，表征基因表达量的准确性有限。
[0006]微量原代细胞、培养细胞、肿瘤组织细胞或类器官细胞等的药物处理实验中，通常采用384微孔板或96微孔板，每个孔的细胞数为几百个细胞至几万个细胞不等。在这些细胞量的基础上，通过常规方法可提取获得的RNA量少，不足以用于后续的大规模基因表达检测。此外，mRNA的分离纯化会进一步增加mRNA损失，特别是低丰度的mRNA的损失更为严重，造成基因表达定量偏差。同时，荧光定量PCR、基因表达芯片和常规RNA
‑
seq等技术需要将RNA反转为cDNA，进一步影响了实验的准确性。
[0007]直接采用细胞裂解液会对后续实验带来便利，但需要考虑细胞裂解后释放的大量细胞碎片、蛋白、基因组DNA、核糖体RNA等成分对后续实验的影响。同时，为了评估多种类型化合物的生物功能，需要检测的RNA种类尽可能多。NanoString技术可以运用于微量细胞裂解液，但NanoString报告探针的6种荧光分子条形码是通过珠子色彩的排列组合来区分探针的。受后续检测仪器和芯片的限制，NanoString的每次实验只能检测12个样本，每个样本
检测800种基因的mRNA，导致NanoString的检测通量及检测基因数受限。
[0008]因此，针对微量复杂样本的384或96微孔板模式，并行性多样本检测上千个基因的表达量，是本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术人提供了一种针对微量复杂样品的构建文库方法。利用本公开的建库方法成功对数百个细胞的裂解液中的纳克(ng)级别的RNA解析出多达数千种的RNA表达量，理论上甚至可以解析全基因组RNA的表达量。与荧光定量PCR的对比实验表明利用本公开的建库方法可以进行准确定量。
[0010]因此，在第一方面，本公开提供了一种构建测序文库的方法，包括以下步骤：1)提供含mRNA的样品溶液；2)通过磁珠富集样品溶液中的mRNA；3)加入至少一个基因探针组合，所述至少一个基因探针组合中的每一个基因探针组合包括第一探针序列和第二探针序列；4)加入封闭序列；5)退火，使基因探针组合与mRNA杂交；6)加入核酸连接酶，使杂交到mRNA的每一个基因探针组合中的第一探针序列和第二探针序列连接，形成核酸分子；7)加入洗脱缓冲液，使核酸分子与mRNA分离；8)以核酸分子为模板，在DNA聚合酶的作用下使封闭序列延伸，将模板互补为DNA双链；9)以DNA双链为模板进行PCR扩增，构建测序文库；其中，所述第一探针序列靶向mRNA的5
’
端，所述第一探针序列包括3
’
端通用接头序列、UMI分子序列和5
’
端特异互补序列，所述第二探针序列靶向mRNA的3
’
端，所述第二探针序列包括3
’
端特异互补序列、UMI分子序列和5
’
端通用接头序列，所述封闭序列结合至所述第一探针的所述3
’
端通用接头序列。
[0011]在一个实施方案中，样品溶液为细胞裂解液，所述细胞选自原代细胞、培养细胞、肿瘤组织细胞和类器官细胞。在一个实施方案中，样品溶液为微量细胞裂解液。在一个实施方案中，微量细胞裂解液为数百个(如100～900个)细胞的裂解液。在一个实施方案中，微量细胞裂解液为单个细胞的裂解液。
[0012]在一个实施方案中，磁珠为oligo
‑
dT磁珠或链霉亲和素磁珠。
[0013]在一个实施方案中，磁珠相对于样品溶液是过量的。
[0014]在一个实施方案中，步骤2)至步骤4)以任意顺序进行或同时进行。
[0015]在一个实施方案中，退火在37℃
‑
45℃的温度下进行。
[0016]在一个实施方案中，构建测序文库的方法还包括在步骤5)之后且在步骤6)之前使用核酸连接酶缓冲液悬浮磁珠和使用磁力架吸附磁珠的步骤。
[0017]在一个实施方案中，构建测序文库的方法还包括在步骤6)之后且在步骤7)之前使用漂洗缓冲液悬浮磁珠和使用磁力架吸附磁珠的步骤。
[0018]在一个实施方案中，核酸连接酶为具有催化杂交链中单链连接能力的连接酶，如T4DNA连接酶或SplitR连接酶。
[0019]在一个实施方案中，在步骤9)中，使用分别与所述3
’
端通用接头序列和所述5
’
端通用接头序列互补的一对引物进行PCR扩增，所述一对引物中的至少一个(优选两个)引物包含index序列。通过使用优选的双端index，在同一个测序芯片中可以混合更多的样本，大大降低了建库产物的测序成本。
[0020]在一个实施方案中，5
’
端特异互补序列或3
’
端特异互本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建测序文库的方法，包括以下步骤：1)提供含mRNA的样品溶液；2)通过磁珠富集样品溶液中的mRNA；3)加入至少一个基因探针组合，所述至少一个基因探针组合中的每一个基因探针组合包括第一探针序列和第二探针序列；4)加入封闭序列；5)退火，使基因探针组合与mRNA杂交；6)加入核酸连接酶，使杂交到mRNA的每一个基因探针组合中的第一探针序列和第二探针序列连接，形成核酸分子；7)加入洗脱缓冲液，使核酸分子与mRNA分离；8)以核酸分子为模板，在DNA聚合酶的作用下使封闭序列延伸，将模板互补为DNA双链；9)以DNA双链为模板进行PCR扩增，构建测序文库；其中，所述第一探针序列靶向mRNA的5
’
端，所述第一探针序列包括3
’
端通用接头序列、UMI分子序列和5
’
端特异互补序列，所述第二探针序列靶向mRNA的3
’
端，所述第二探针序列包括3
’
端特异互补序列、UMI分子序列和5
’
端通用接头序列，所述封闭序列结合至所述3
’
端通用接头序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品溶液为细胞裂解液，所述细胞选自原代细胞、培养细胞、肿瘤组织细胞和类器官细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述磁珠为oligo
‑
dT磁珠或链霉亲和素磁珠。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤2)至步骤4)以任意顺序进行或同时进行。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述退火在37℃
‑
45℃的温度下进行。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括在步骤5)之后且在步骤6)之前使用核酸连接酶缓冲液悬浮磁珠和使用磁力架吸附磁珠的步骤。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括在步骤6)之后且在步骤7)之前使用漂洗缓冲液悬浮磁珠和使用磁力架吸附磁珠的步骤。8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核酸连接酶为T4 DNA连接酶或SplitR连接酶。9.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤9)中，使用分别与所述3
’
端通用接头序列和所述5
’
端通用接头序列互补的一对引物进行PCR扩增，所述一对引物中的至少一个(优选两个)引物包含index序列。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述5
’
端特异互补序列或3
’
端特异互补序列的长度为20
‑
25bp；所述UMI分...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵伟，肖梅，陈军，王栋，许俊泉，
申请(专利权)人：格物智造科技成都有限公司，
类型：发明
国别省市：