DNA甲基化标志物筛查试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及DNA甲基化标志物筛查试剂盒及方法。本发明专利技术方法包括酶切、甲基化接头连接、甲基化处理和索引引物扩增，其中，使用对甲基化不敏感的限制性内切酶对感兴趣DNA序列进行所述酶切，获得酶切产物，其中，所述酶切产物未经末端修复和补齐而直接与带有甲基化修饰的接头连接，且其中，所述酶切产物包含具有粘性末端的酶切产物和任选的具有平末端的酶切产物。本发明专利技术也提供相应的接头序列、索引引物序列、经过优选的试剂、试剂盒以及相关的应用。试剂盒以及相关的应用。

【技术实现步骤摘要】
DNA甲基化标志物筛查试剂盒及方法
[0001]本分案申请是申请号为201910793968.7、申请日为2019年8月27日、专利技术名称为“DNA甲基化标志物筛查试剂盒及方法”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及DNA甲基化标志物筛查试剂盒及方法。

技术介绍

[0003]DNA甲基化主要发生在CpG岛，是重要的表观遗传修饰。已知DNA甲基化参与基因转录调控过程，并与众多生物学过程相关，包括癌症的形成。筛选与生物学过程相关的DNA甲基化标志物的方法包括全基因组重亚硫酸氢盐测序法(WGBS)和简化甲基化测序(RRBS)等。WGBS检测虽然全面，但是成本较高，测序大量非DNA甲基化修饰区域。相比较于WGBS，RRBS能够富集CpG位点，大大减少测序成本。传统的RRBS经酶切富集CpG位点，进行末端补齐，通过TA连接方式加上接头，再进行扩增反应。这一方法的缺点是DNA建库起始用量较大，对启动子区及CpG岛区域CpG位点富集程度低(特别是对于DNA质量较差的FFPE样本)，不同样本之间位点重现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建DNA甲基化文库的方法，其特征在于，所述方法依次包括酶切，甲基化接头连接，采用琼脂糖凝胶割胶回收方法、配置胶割胶回收方法、磁珠纯化片段筛选方法或Blue Pippin法回收连接产物，甲基化处理和索引引物扩增；其中，使用对甲基化不敏感的限制性内切酶对感兴趣DNA序列进行所述酶切，获得酶切产物，所述限制性内切酶特异性识别的序列在高GC序列区域有更高的分布；其中，所述酶切产物未经末端修复和补齐而直接与带有甲基化修饰的接头连接；其中，所述酶切产物包含具有粘性末端的酶切产物，所述甲基化接头连接的反应体系中包括具有与酶切产物的粘性末端相匹配的粘性末端的甲基化接头，且反应体系中该甲基化接头的终浓度为0.01
‑
0.05μM；其中，任选地，甲基化接头连接之后，加入打断或未打断的载体DNA。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切产物还包括具有平末端的酶切产物，所述甲基化接头连接的反应体系中还包括具有与该酶切产物的平末端相匹配的平末端的甲基化接头。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对甲基化不敏感的限制性内切酶选自MSPI、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI中的一种或多种；所述甲基化接头连接包括使用5
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App DNA/RNA连接酶、T4 RNA连接酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、CircLigase连接酶、电转连接酶、平末端/TA连接酶、瞬时黏性连接酶、HiFi Taq DNA连接酶中的一种或多种将甲基化接头连接到酶切产物；使用亚硫酸氢盐转化试剂盒进行所述甲基化处理；使用分别含有与所述甲基化接头中未互补的部分互补的序列的索引引物进行索引引物扩增。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用选自Phusion U Hot Start DNA聚合酶、PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和LafU DNA聚合酶中的一种或多种DNA聚合酶进行所述索引引物扩增。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括，酶切前，使用磁珠或柱纯化方法纯化基因组DNA。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法依次包括：使用磁珠或柱纯化方法纯化基因组DNA，获得纯化的DNA；使用选自MSPI、HaeIII、BanII、HpyCH4V、AluI、SphI和BssSI中的一种或多种对所述纯化的DNA进行酶切，获得酶切产物；对所获得的酶切产物进行甲基化接头连接，其中，使用选自T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、T7 DNA连接酶和T3 DNA连接酶的一种或多种进行连接，获得连接产物；采用配置胶割胶回收方法纯化所述连接产物；使用亚硫酸氢盐转化方法对纯化的连接产物进行甲基化处理；和使用选自Phusion U Hot Start DNA聚合酶、PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶中的一种或多种DNA聚合酶对经甲基化处理的产物进行索引引物扩增。7.如权利要求1
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6中任一项所述的方法，其特征在于，
所述甲基化接头选自下组甲基化接头序列中的一种或多种：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:7与SEQ ID NO:8形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:12形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:13与SEQ ID NO:14形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:17与SEQ ID NO:18形成的甲基化接头序列；SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:20形成的甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘蕊，
申请(专利权)人：江苏鹍远生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：