防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法技术

本发明专利技术特别涉及一种防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法，该方法包括：制备含有待测靶标分子的样本，利用磁珠捕获待测靶标分子，并且通过亲和反应形成“磁珠

【技术实现步骤摘要】
防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测，特别涉及一种防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法。

技术介绍

[0002]目前，市场上已有多种定量检测低浓度分析物的检测技术。
[0003]一类采用高灵敏度的光学仪器来检测单分子信号，代表性的产品有默克公司的SMC
TM
(Single Molecule Counting)系统，然而该系统的光路结构复杂、昂贵，检测速度慢，针对微球进行串行检测，检测时间也很长。
[0004]另一类采用扩增技术来增加待测靶标分子的数量，以提供足够多的信号分子，代表性的产品有Chimera公司的系统，然而该系统的测定方法复杂且容易产生假阳性信号。
[0005]Quanterix公司的Simoa
TM
(Single
‑
molecule Array)系统则采用类似数字PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)的数字ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，酶联反应免疫分析)技术，然而该系统中的单个反应检测单元的本底信号高，并且单个反应检测单元内生成的荧光物质会扩散到邻近的反应检测单元，从而产生荧光信号串扰，影响阴性信号和阳性信号的判别准确度。
[0006]因此，亟需一种防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法，降低反应体系的荧光信号背景，并且降低反应检测单元内的荧光信号扩散，从而提高阴性信号和阳性信号的判别准确度。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术中的上述问题，本专利技术提供了一种防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法，降低反应体系的荧光信号背景，并且降低反应检测单元内的荧光信号扩散，从而提高阴性信号和阳性信号的判别准确度。
[0008]本专利技术提供了一种防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法，所述方法包括：
[0009]步骤1、制备样本，所述样本含有待测靶标分子，利用磁珠捕获所述样本中的所述待测靶标分子，并且通过亲和反应形成“磁珠
‑
待测靶标分子
‑
酶”的复合物；
[0010]步骤2、将形成有所述复合物的所述样本转移到微孔阵列芯片中，其中，所述微孔阵列芯片包括微孔阵列和容纳所述微孔阵列的流体腔室，所述微孔阵列中的每个微孔被配置为仅能够容纳一个磁珠；
[0011]步骤3、将荧光底物转移到所述微孔阵列芯片中，所述酶能够与所述荧光底物进行酶促反应以生成荧光分子；
[0012]步骤4、将隔离液加入到所述微孔阵列芯片中，以将所述微孔阵列中的所有微孔彼此隔离；
[0013]步骤5、等待所述酶与所述荧光底物进行酶促反应以生成所述荧光分子，其中，捕获有单个待测靶标分子的磁珠所处的微孔的荧光信号高于阈值，并且捕获有零个待测靶标
分子的磁珠所处的微孔的荧光信号低于阈值；
[0014]步骤6、确定所述微孔阵列中的含有所述磁珠的微孔的数量，并且确定所述微孔阵列中的荧光信号高于阈值的微孔的数量；
[0015]步骤7、基于所述微孔阵列中的含有所述磁珠的微孔的数量以及所述微孔阵列中的荧光信号高于阈值的微孔的数量，并且基于所述样本中的所述磁珠的数量以及所述待测靶标分子被所述磁珠捕获并进一步与所述酶结合的几率，确定所述样本中的所述待测靶标分子的数量。
[0016]本专利技术的一个实施例中，所述隔离液为氟油，所述氟油在25℃下的粘滞系数在0.1cSt至12500cSt的范围内。
[0017]本专利技术的一个实施例中，所述氟油在25℃下的粘滞系数在1cSt至5000cSt的范围内。
[0018]本专利技术的一个实施例中，所述氟油在25℃下的粘滞系数为11.4cSt、451cSt或1366cSt。
[0019]本专利技术的一个实施例中，所述隔离液为硅油，所述硅油在25℃下的粘滞系数在10cSt至12500cSt的范围内。
[0020]本专利技术的一个实施例中，所述硅油在25℃下的粘滞系数在10cSt至5000cSt的范围内。
[0021]本专利技术的一个实施例中，所述硅油在25℃下的粘滞系数为350cSt。
[0022]本专利技术的一个实施例中，基于粒子计数仪、流式细胞术或细胞计数板的计数方式来确定所述样本中的所述磁珠的数量。
[0023]本专利技术的一个实施例中，所述样本中的所述磁珠的数量与所述样本中的所述待测靶标分子的数量的比值大于等于5。
[0024]本专利技术的一个实施例中，在所述步骤6中，对所述微孔阵列拍摄一个或多个视野的明场图像和荧光图像，其中，基于所述一个或多个视野的明场图像来确定所述微孔阵列中的含有所述磁珠的微孔的数量，并且基于所述一个或多个视野的荧光图像来确定所述微孔阵列中的荧光信号高于阈值的微孔的数量。
[0025]本专利技术的一个实施例中，在所述步骤7中，采用以下公式来确定所述样本中的所述待测靶标分子的数量：其中，M0是所述样本中的所述待测靶标分子的数量，N0是所述样本中的所述磁珠的数量，M是所述微孔阵列中的荧光信号高于阈值的微孔的数量，N是所述微孔阵列中的含有所述磁珠的微孔的数量，并且p是所述待测靶标分子被所述磁珠捕获并进一步与所述酶结合的几率。
[0026]本专利技术的一个实施例中，所述微孔阵列中的所有微孔的数量与所述样本中的所述磁珠的数量的比值在0.1至10的范围内。
[0027]本专利技术的一个实施例中，在所述步骤2中，通过自吸、离心或压力进样的方式，将形成有所述复合物的所述样本转移到所述微孔阵列芯片的所述流体腔室以及所述微孔阵列的所述微孔中，并且通过离心的方式，移除所述流体腔室中的多余磁珠，并且保留所述微孔中的磁珠。
[0028]本专利技术的一个实施例中，在所述步骤3中，通过自吸、离心或压力进样的方式，将所
述荧光底物转移到所述微孔阵列芯片的所述流体腔室以及所述微孔阵列的所述微孔中，并且通过离心的方式，移除所述流体腔室中的多余荧光底物，并且保留所述微孔中的荧光底物。
[0029]本专利技术的一个实施例中，在所述步骤4中，通过自吸、离心或压力进样的方式，将所述隔离液加入到所述微孔阵列芯片的所述流体腔室中，并且对所述微孔阵列的所述微孔中的磁珠和荧光底物进行密封和隔离。
[0030]本专利技术的一个实施例中，所述待测靶标分子为待测蛋白分子。
[0031]如上所述，本专利技术具有以下有益效果：
[0032]本专利技术可以通过由粒子计数仪、流式细胞术或细胞计数板等计数方式所明确确定的样本分配单元的数量、由一个或多个视野的明场图像所确定的反应检测单元的数量、由一个或多个视野的荧光图像所确定的阳性反应检测单元的数量以及作为常数的待测靶标分子被磁珠捕获并进一步与酶结合的几率，来绝对定量样本中的待测靶标分子。
[0033]在本专利技术中，样本中的磁珠的数量决定动态检测范围的上限，通过改变样本中的磁珠的数量，可以精确控制动态检测范围。理论上，动态检测范围的上限小于5倍的磁本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种防荧光信号串扰的数字ELISA检测方法，其特征在于，所述方法包括：步骤1、制备样本，所述样本含有待测靶标分子，利用磁珠捕获所述样本中的所述待测靶标分子，并且通过亲和反应形成“磁珠
‑
待测靶标分子
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酶”的复合物；步骤2、将形成有所述复合物的所述样本转移到微孔阵列芯片中，其中，所述微孔阵列芯片包括微孔阵列和容纳所述微孔阵列的流体腔室，所述微孔阵列中的每个微孔被配置为仅能够容纳一个磁珠；步骤3、将荧光底物转移到所述微孔阵列芯片中，所述酶能够与所述荧光底物进行酶促反应以生成荧光分子；步骤4、将隔离液加入到所述微孔阵列芯片中，以将所述微孔阵列中的所有微孔彼此隔离；步骤5、等待所述酶与所述荧光底物进行酶促反应以生成所述荧光分子，其中，捕获有单个待测靶标分子的磁珠所处的微孔的荧光信号高于阈值，并且捕获有零个待测靶标分子的磁珠所处的微孔的荧光信号低于阈值；步骤6、确定所述微孔阵列中的含有所述磁珠的微孔的数量，并且确定所述微孔阵列中的荧光信号高于阈值的微孔的数量；步骤7、基于所述微孔阵列中的含有所述磁珠的微孔的数量以及所述微孔阵列中的荧光信号高于阈值的微孔的数量，并且基于所述样本中的所述磁珠的数量以及所述待测靶标分子被所述磁珠捕获并进一步与所述酶结合的几率，确定所述样本中的所述待测靶标分子的数量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述隔离液为氟油，所述氟油在25℃下的粘滞系数在0.1cSt至12500cSt的范围内。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：许俊泉，刘燕，褚衍桥，李芳，朱家君，蔡志刚，吴浩扬，
申请(专利权)人：格物智造科技成都有限公司，
类型：发明
国别省市：