一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，包括获取待检患者的检验样本和特征信息、检测样本阳性初筛、构建GFAPα和GFAPε过表达的HEK

【技术实现步骤摘要】
一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法


[0001]本专利技术涉及抗体检测
，特别涉及一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法。

技术介绍

[0002]GFAP是胶质纤维酸性蛋白，是星形胶质细胞活化的标志物。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在。星形胶质细胞具有许多突起，伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用，并参与了血脑屏障的形成。由于星形胶质细胞能产生和分泌某些神经递质以及表达某些神经递质受体，可对一些神经活性物质产生反应。另外，星形胶质细胞能对外源性化合物进行生物转化，并可帮助调节神经元周围的离子微环境。外源性化学物质或外伤损伤中枢神经系统后，损伤区域星形胶质细胞通过增生可形成胶质“瘢痕”。这种增殖多伴随着胶质纤维酸性蛋白的表达增加。因此组织中GFAP升高是中枢神经系统对损伤作出反应的一个标志性信号。GFAP抗体阳性介导的疾病在医学上称为自身免疫胶质纤维酸性蛋白星形细胞病，属于自身免疫性疾病。临床上与其他类型的脑脊髓膜炎相类似，如急性播散性脑脊本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于人血清脑脊液GFAP抗体的双色免疫荧光检测方法，其特征在于：所述的检测方法包括以下步骤：步骤一：获取待检患者的检验样本和特征信息采集待检患者的血清样本和脑脊液样本，并记录采集时待检患者的特征信息；步骤二：检测样本阳性初筛取患者1∶10比例稀释后的血清和脑脊液30μL，加入检测基质中常温下结合3h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合2h，PBS冲洗3次，甘油
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PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；步骤三：构建GFAPα和GFAPε过表达的HEK
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293T细胞模型具体步骤为：S1，构建真核表达载体利用PCR技术获取目的基因，PCR反应条件如下：98℃变性15s，58℃退火15s，68℃延伸90s，共30个循环；68℃延伸5min，1.5％琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，分别取GFAPα和GFAPε的PCR回收产物，用BamHI/XhoI双酶切，pcDNA3.1+载体连接，连接产物分别加入至50μLDH5α感受态细胞中，质粒酶切鉴定阳性克隆，阳性质粒去测序确定；S2，细胞转染当细胞株进行传代至汇合度为70％～80％时，使用Opti
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MEM培养基，并采用Lipofectamine2000转染试剂对细胞进行转染36h后收样，通过western blotting方法检测GFAP蛋白的表达；步骤四：利用过表达GFAPα和GFAPε的HEK
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293T细胞模型确证GFAP抗体取经步骤二中初筛阳性的患者1∶10比例稀释后血清和脑脊液各15μL，与过表达的细胞在常温下结合1h，PBS冲洗3次，加用荧光素结合的羊抗人lgG的二抗，结合1h，PBS冲洗3次，甘油
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PBS液封片，荧光显微镜观察，根据判定标准判断是否为阳性的标本；步骤五：构建患者特征信息与阳性率关联的数学模型S1，构建患者特征信息数据库，对数据库中的特征信息数据进行数据归一化处理；S2，构建以阳性率为结局变量，特征信息为解释变量的随机森林模型具体步骤为：S21，通过简单交叉验证方法对样本随机划分为训练子集和测试子集，其中训练集样本为80％，测试集为20％；S22，通过sklearn库方法对特征进行重要性评估，并根据评分对特征降序排序，运行SWSFS过程筛选最优变量数；S23，利用网格搜索的方式对随机森林在局部范围内找出最优参数；S24，建立决策树，并根据所有决策树的投票结果决定数据的分类；步骤六：评价模型预测性能，根据分类结果计算阳性率根据分类结果获取阳性率值，使用混淆矩阵进行预测结果的分类，并通过计算模型预测的准确性，对模型的预测性能进行量化评价，计算公式为：其中acc为模型预测的准确性值；TP为特征信息数据库中真正例个数；TN为...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵雪，高峰，张婧，吕杰，张迎娜，方华，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：