Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、Flag抗体scFv1及其应用技术

本发明专利技术提供一种KLH

【技术实现步骤摘要】
Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、Flag抗体scFv1及其应用


[0001]本专利技术专利涉及一种Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，以及筛选到的Flag抗体scFv1及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]FLAG
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tag是一段由8个氨基酸残基组成的，N
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DYKDDDDK
‑
C(1012Da),其作用通常是作为标记标签。在蛋白表达纯化的生产中，可以通过基因工程技术手段将所要研究的目的基因和FLAG
‑
tag基因序列连接起来，使Flag标签连接在目的蛋白的C端或N端，然后将整合后的基因转入原核或真核细胞中。后续的检测和纯化主要通过FLAG
‑
tag这段肽链形成的免疫决定簇与其单克隆抗体的特异性结合来实现。检测手段有免疫荧光(immunofluorescence)，免疫印记(Western Blotting)等。
[0003]因为Flag标签是蛋白类生物制品生产质控中最常用和最稳定的标签蛋白之一，在蛋白质表达纯化的科学研究和工业生产中应用广泛，市场需求量大，所以筛选一株对Flag标签具有高亲和力的抗体是很有必要的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法。
[0005]一种Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于其步骤包括：
[0006](1)用Flag蛋白免疫兔，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；
[0007](2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；
[0008](3)构建pCANTAB5E
‑
2SFi1
‑
scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；
[0009](4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆。
[0010]步骤(2)中PCR技术使用的引物如下：
[0011][0012][0013]步骤(2)中重链VH上游引物IgG
‑
sfi1
‑
VH
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F和下游引物IgG
‑
VH
‑
R交叉配对混合后进行PCR，轻链VL上游引物IgG
‑
VL
‑
F和下游引物IgG
‑
sfi1
‑
VL
‑
R一一配对混合进行PCR，将获得的轻链VL和重链VH的PCR产物回收并等摩尔混合作为模板，使用引物表中相对应的重链上游引物和轻链下游引物进行PCR。
[0014]步骤(4)中特异性富集噬菌体单链抗体库，具体指取抗原与PBS混匀后包被于96孔板，用5％BSA作为封闭液，添加噬菌体单链抗体库室温孵育；
[0015]洗脱：加入100mM HCl，室温孵育5min后，用枪头用力吹打后收集，收集管内加入1M Tris
‑
HCl中和pH，再加入BSA溶液稀释；
[0016]洗脱产物扩增：取洗脱产物加入TG1菌液中培养，加入辅助噬菌体继续培养，菌液离心，用2
×
YT培养基重悬沉淀，过夜震荡培养；第二天将菌液离心，上清液体转移至新的离心管，加入PEG
‑
NaCl，冰上静置沉析后离心，然后去除上清，用BSA溶液重悬沉淀，转至另一EP管，离心，去除沉淀，上清即为扩增富集产物；
[0017]重复上述步骤，进行4轮淘选，提高每轮淘选严苛程度，富集得到具有亲和力的噬菌体。
[0018]本专利技术还公开了一种Flag单克隆抗体scFv，其轻链可变区序列为：
[0019]DMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQSSQSVYLNNDLAWFQQKPGQPPKLLIYYASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDVVCDDAATYYCVGYKSSSIDGVAFGGGTELEIL(SEQ ID No.1)，
[0020]其中轻链可变区CDR1氨基酸序列为：QSSQSVYLNNDLA，
[0021]轻链可变区CDR2氨基酸序列为：YASTLAS，
[0022]轻链可变区CDR3氨基酸序列为：VGYKSSSIDGVA；
[0023]重链可变区序列为：
[0024]QQQLVESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLHSYAMSWVRQAPGKGLEWIGTIEFNDNTYYASWPKGRFTISKTSTAVDLKMTSLTAADTGTYFCVRSSNGWSQTIWGPGTLVTVSS(SEQ ID No.2)，
[0025]其中重链可变区CDR1氨基酸序列为：SYAMS，
[0026]重链可变区CDR2氨基酸序列为：TIEFNDNTYYASWPKG，
[0027]重链可变区CDR3氨基酸序列为：SSNGWSQTI。
[0028]命名为scFv1。
[0029]本专利技术的Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，可筛选得到具有高亲和力的兔源单链抗体，可构建出库容量2.4.0
×
109、重组噬菌体滴度为1.0
×
10
13
pfu/ml、重组率为100％的噬菌体单链抗体库。本专利技术的单链抗体可以通过大肠杆菌BL21表达得到。
附图说明
[0030]图1是提取的总RNA电泳图。
[0031]图2是轻链VL、重链VH基因的PCR产物凝胶电泳图。
[0032]图3是scFv基因PCR产物凝胶电泳图。
[0033]图4是pCANTAB5E
‑
2sfi1质粒双酶切前后电泳图。
[0034]图5是连接产物电转化的平板图。
[0035]图6是菌落PCR鉴定图。
[0036]图7是该scFv抗体的亲和力检测结果(IgM
‑
Flag
‑
中间)
[0037]图8是该scFv抗体的亲和力检测结果(IgM
‑
Flag
‑
C端)。
[0038]图9是最终筛选出的抗体用于WB检测结果图。
具体实施方式
[0039]1.生物材料
[0040]新西兰大白兔，辉煌养殖场
[0041]2.实验试剂与耗材
[0042]表1实验试剂与耗材
[0043][0044][0045]实施例1噬菌体展示抗体库的构建
[0046]1.1动物免疫和脾细胞总RNA的提取
[0047]用Flag
‑
KLH免疫约2kg的新西兰大白兔，每两周皮下免疫一次，初次免疫用弗式完全佐剂乳化Flag
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KLH，加强免疫用非完全佐剂乳化，首次免疫剂量为0.5mg蛋白，以后每次免疫剂量为0.25mg,免疫2月后，即取脾脏前3天，用0.25mg的蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Flag免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于其步骤包括：(1)用KLH
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Flag蛋白免疫新西兰大白兔，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；(2)利用PCR技术，以步骤(1)获得的cDNA为模板，扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；(3)构建pCANTAB5E
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2sfi1
‑
scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，用scFv
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Flag融合蛋白从中筛选出阳性克隆；其中步骤(2)中PCR技术使用的引物如下：IgG
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sfi1
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VH
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F1：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCCGGCCCAGTCGCTGGAGIgG
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sfi1
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VH
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F2：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCYGGCCCWGTCGCTGGAGIgG
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sfi1
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VH
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F3：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCCKGCCCWGTCGCTGGAGIgG
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sfi1
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VH
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F4：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCNGGCRCAGTCGWTGGAGIgG
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sfi1
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VH
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F5：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCCKGCCCWGTCGHTGGAGIgG
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sfi1
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VH
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F6：ACCCAGCTGACCGTCACACAGCCKGCCCWGTCNKTGGAGIgG
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sfi1
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VH
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F7：ACCCAGCTGACCGTCACWCAWCCKGCCCWGTCGCTGGAGIgG
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sfi1
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VH
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R1：TCCAGAACCTCCACCTCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTIgG
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sfi1
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VH
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R2：TCCAGAACCTCCACCTCCTGAGGAGACGGTGACCAGGCNIgG
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sfi1
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VH
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R3：TCCAGAACCTCCACCTCCTGAATHGACGGTGACCAGGGTIgG
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sfi1
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VH
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R4：TCCAGAACCTCCACCTCCTGAGARGACGGTGACCAGGGTIgG
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sfi1
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VL
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F1：AGTGGTGGTGGAGGATCTGATCTNACCCAGACTCCATCCIgG
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sfi1
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VL
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F2：AGTGGTGGTGGAGGATCTGATATHACCCAGARTCCATCCIgG
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sfi1
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VL
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F3：AGTGGTGGTGGAGGATCTGATCTGACCCRGACTCDATCCIgG
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sfi1
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VL
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F4：AGTGGTGGTGGAGGATCTGABCTGACCCY...

【专利技术属性】
技术研发人员：易红飞，向蜀州，朱倩静，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：