一种高通量筛选microRNA靶基因的文库、构建方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种高通量筛选microRNA靶基因的文库、构建方法及其用途。构建方法包括提取待测样本的总RNA，纯化mRNA；逆转录第一链/第二链，获得全长mRNA；将全长mRNA逆转录产物第一链和第二链酶切，断裂得到DNA双链片段；利用DNA连接酶在断裂的双链DNA两端分别加5

【技术实现步骤摘要】
一种高通量筛选microRNA靶基因的文库、构建方法及其用途


[0001]本专利技术属于生物工程与医学工程学领域，涉及microRNA靶基因筛选技术，具体涉及一种高通量筛选microRNA靶基因的文库、构建方法及其用途。

技术介绍

[0002]微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的单链小RNA分子，广泛存在于线虫、果蝇、植物和动物的真核生物细胞中，于1993年首次在线虫中被发现，是一类发挥重要作用的基因表达调控因子。microRNA具有高度的保守性、组织特异性和时序性，不具有开放阅读框(open reading frame,ORF)，属于非编码RNA。大部分microRNA的基因位于编码基因的内含子区，也有一部分存在于编码基因间的DNA片段中。
[0003]在大多数哺乳动物中，microRNA通过5'
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末端第2～8位的序列与靶基因mRNA互补配对，在翻译水平负调控基因的表达，5'
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末端的这2～8位的碱基序列被称为种子序列，它在各个物种中都是高度保守的，并且通过与靶mRNA完全互补配对介导基因的表达调控。许多研究表明正是microRNA的第2～8位的种子序列的突变或者与之完全互补配对靶mRNA的突变导致此microRNA功能缺失，进而引起生理状态的改变。
[0004]microRNA调控基因表达的机制相当复杂，每种microRNA能调控上百种靶基因，而每个靶基因可能同时受到百余种microRNAs的调节。microRNA作为一种重要的调控因子，在哺乳动物生长发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、细胞内环境稳态等生命活动中起到重要的调节作用。根据miRBase数据库，目前所发现的人类microRNAs已超过2500个，随着高通量测序等科学技术的发展，将会有更多的新的microRNA被发现。可能近90％的人类基因均会受到microRNA的调控。然而，当过表达或抑制某microRNA时，在发生调变的众多基因当中寻找并鉴定其中起关键作用的靶基因仍然具有相当大的挑战。
[0005]快速准确的鉴定出microRNA的靶基因，对于研究microRNA与靶基因之间的相互作用和参与的生物过程以及在信号通路中发挥的作用具有极大的价值。目前鉴定microRNA靶基因的方法主要分为生物信息学方法和生物学实验方法。
[0006]生物信息学方法：microRNA与靶基因间的相互作用具有一定的规律性。动物源microRNA主要通过与靶基因mRNA的3'
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UTR碱基互补结合，从而调控靶基因的表达，因此动物源microRNA的靶位点主要位于靶基因mRNA的3'
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UTR，同时这些区域往往包含多个microRNA的多个靶位点，这些靶位点往往具有物种间保守性，且无明显二级结构。生物信息学方法主要是利用已经确定的microRNA
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靶基因序列相互匹配的规律，根据生物学的原则设计具有针对性的软件来进行分析的，如miRanda，TargetScan和TargetScanS，RNAhybrid，DIANA
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microT，PicTar，FindTar和RNA22等软件。目前常规的算法主要遵循以下几个原则：(1)microRNA与靶基因的互补性；(2)microRNA靶位点在不同物种之间的保守性；(3)microRNA
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mRNA双链之间的热稳定性；(4)microRNA靶位点不会形成复杂的二级结构；(5)microRNA的5'
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末端与靶基因的结合能力强于3'
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末端。除了这些基本原则以外，不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行限制和优化。计算机预测速度快、操作简单，但
这种主要基于microRNA种子序列与其靶基因之间碱基互补配对的最小自由能的计算方法，由于短小序列的存在，容易出现假阳性，因此生物信息学的方法只是通过算法为研究人员提供可能性最大的参考信息，后续的实验验证仍然是不可或缺的，并且需要实验验证的数据反证生物信息学预测的原理是否符合实际。
[0007]生物学实验方法：目前主要是从转录水平与蛋白质水平来寻找microRNA的靶基因。从转录水平来寻找靶基因主要有三种方法：芯片杂交、二代测序和RT
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PCR，三种方法均是通过在细胞内过表达某种microRNA后，利用基因芯片、二代测序或逆转录PCR分析mRNA的变化情况，以找出相应microRNA的靶基因。这种方法由于microRNA所介导的转录后翻译抑制过程并不会引起mRNA水平的改变，另外，有些mRNA的改变是由于靶mRNA的改变而发生的从属性变化等情况。因此依据mRNA水平的变化寻找microRNA靶基因的方法存在一定局限性。
[0008]从蛋白质水平寻找microRNA靶基因的方法同样主要分为两种：蛋白质谱和免疫印迹(Western blot)。利用蛋白质质谱来寻找microRNA靶基因已经日渐成为一种新的策略，通过某一特定microRNA作用后，用质谱高通量检测蛋白质表达谱，其中表达下调的蛋白均为潜在的该microRNA的靶蛋白。此外，Western blot方法可以检测转染或敲低microRNA后细胞中蛋白质水平的变化，从而确定该microRNA与靶基因的对应关系。
[0009]对于蛋白质谱、基因芯片和二代测序而言，虽然可以达到高通量的目的，但所获结果中，会存在大量被网络变化牵动的二次演变的数据，并不能有效地区分这些变化是microRNA直接作用还是间接作用而导致的，即有一些蛋白质是被关键蛋白改变后牵连变化的，这种相互作用不是直接相互作用的靶标关系。而对于RT
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PCR和Westernblot而言，既难以达到高通量又非直接相互作用。
[0010]除了上述的转录组水平和蛋白质组水平的检测方法外，microRNA的靶位点的鉴定最常用的方法是荧光素酶报告基因检测系统，其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将预鉴定的microRNA靶基因的3'
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UTR构建到荧光素酶基因的3'
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UTR中，然后将荧光素酶基因表达载体转染细胞并改变细胞中该microRNA的水平，检测荧光素酶的表达情况及荧光强度以分析转染3'
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UTR中是否含有该microRNA的靶位点。传统的荧光素酶报告基因检测系统只能检测一对一的直接相互关系，无法达到高通量检测的目的，而本专利技术正是针对此不足，发展出可以高通量检测基于荧光素酶报告基因的检测系统，即此系统既能检测microRNA
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靶基因的直接相互作用外，又达到了高通量筛选的目的。

技术实现思路

[0011]为解决以上问题，本专利技术提供了一种高通量筛选microRNA靶基因的文库，并给出了文库构建方法和用途，很好地兼顾了高通量筛选和验证直接的真实相互作用。
[0012]本专利技术的第一个目的在于提供一种高通量筛选microRN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量筛选microRNA靶基因的文库构建方法，其特征在于，包括：(1)提取待测样本的总RNA，纯化mRNA；(2)逆转录第一链/第二链，获得全长mRNA；(3)将全长mRNA逆转录产物第一链和第二链酶切，断裂得到DNA双链片段；(4)利用DNA连接酶在断裂的双链DNA两端分别加5
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端和3
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端接头，得到第一连接产物；(5)高保真酶扩增，得到高保真扩增的DNA产物；(6)Nhe1/Kpn1双酶切高保真扩增的DNA产物，得到双酶切的文库DNA；连接双酶切重组载体及所述双酶切的文库DNA；转导HB101；构建/扩增文库。2.如权利要求1所述的一种高通量筛选microRNA靶基因的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，逆转录第一链/第二链，获得全长mRNA的过程包括：以Oligo(dT)n为引物，从3
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polyA尾部逆转录mRNA，合成cDNA第一链和第二链；插入pMD19
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T载体，转导工程大肠杆菌DH5α，铺板扩增，得全长mRNA文库。3.如权利要求1所述的一种高通量筛选microRNA靶基因的文库构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述全长mRNA逆转录产物第一链和第二链利用RsaI酶切，断裂成长度在500
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2000bp之间的DNA双链片段。4.如权利要求1所述的一种高通量筛选microRNA靶基因的文库构建方法，其特征在于，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶；所述5

【专利技术属性】
技术研发人员：宋春娇，袁成良，
申请(专利权)人：德阳市人民医院，
类型：发明
国别省市：