基于夹心ELISA的纳米等离子共振生物芯片以及快速定性定量检测目标物的方法技术

本发明专利技术公开一种基于夹心ELISA的纳米等离子共振生物芯片以及快速定性定量检测目标物的方法，属于抗原的等离子共振定量检测技术领域；包括基片和修饰在基片上的目标物的包被抗体；基片包括基底和镀在基底表面的1

【技术实现步骤摘要】
基于夹心ELISA的纳米等离子共振生物芯片以及快速定性定量检测目标物的方法


[0001]本专利技术属于抗原的等离子共振定量检测
，特别是基于夹心ELISA的纳米等离子共振快速定性定量检测。

技术介绍

[0002]酶联免疫吸附测定(ELISA)作为传统的夹心免疫测定法，检测速度快、费用低廉，在血清标志物检测分析中应用广泛，但这种检测方法的检测限度有限，检测过程相对繁琐耗时，酶标抗体不耐储存，酶催化反应条件相对苛刻。因而，开发一种信号稳定、高灵敏的，具有普遍性和易于实施的生物标志物检测策略在临床诊断和治疗监测中具有的重要意义。
[0003]纳米表面等离子共振技术(NanoSPR)是一项完全不同于等离子共振芯片技术(SPR)和局部表面等离子体共振技术(LSPR)的全新定性定量检测技术。表面等离子共振(SPR)主要是建立在全反射模式上，利用衰减全反射棱镜耦合方法，实现激光激发表面等离子波，通过检测全反射角度的变化，引起消光光谱的移动，进而获取生化反应的信息。局部表面等离子体共振技术(LSPR)则是当光线入射到由贵金属构成的纳米颗粒上，且入射光子频率与贵金属纳米颗粒或金属传导电子的整体振动频率相匹配时，纳米颗粒或金属会对光子能量产生很强的吸收作用，在光谱上出现一个强的共振吸收峰。
[0004]然而，纳米表面等离子体共振(NanoSPR)是通过入射光与金属纳米结构的共振耦合，利用表面等离子体共振的波长对于纳米结构周围介电环境的敏感性，实现对生化反应的检测。当吸附分子的折射率与周围环境的折射率存在差异时，吸附于基底表面的生物分子与目标分子的反应会改变基底表面的折射率，从而引起共振峰的变化，实现目标物质的检测。因此，纳米表面等离子体传感器的共振分析无需使用传统SPR技术那样的复杂光学系统，与LSPR在技术原理上也存在明显的差异。
[0005]现有技术中，例如中国专利申请CN110779905A提供了一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条、制备方法及使用方法，该方法是在共轭垫上包被金纳米棒，在金纳米棒表面修饰有拉曼分子和牛血清白蛋白。拉曼分子作为拉曼报告分子，用于反馈在激发光下最大表面增强拉曼散射的信号。牛血清白蛋白(BSA)能增强金纳米棒的稳定性，防止金纳米棒彼此聚集，影响性能。上述试纸条通过包被鼠抗人甲胎蛋白检测抗体等肿瘤标志物检测抗体，从而实现抗原肿瘤标志物的拦截。
[0006]又例如中国专利申请CN101617229A提供了一种LSPR的酶测定的方法，该方法是利用固定化酶与底物产生不溶性沉淀，这种沉淀在LSPR表面聚集，引起表面反射光或透射光的变化；具体而言是在金包被表面固定用于检测目标物的第一捕获抗体，然后利用第一捕获抗体和第二捕获抗体与目标物结合，再加入酶底物氯化硝基蓝四氮唑(NBT)、5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3′‑
吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(BCIP)、3，3
′
，5，5
′‑
四甲基联苯胺(TMB)、4
‑
氯
‑1‑
萘酚(4
‑
CN)和3，3
′‑
二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)，使结合物形成不溶性沉淀，这种沉淀在进行检测时使得金颗粒的消光谱朝长波长的方向位移。
[0007]然而，上述这两种方法都存在检测灵敏度不高，检测光路系统复杂，检测通量低等不足。

技术实现思路

[0008]针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了基于夹心ELISA的纳米等离子共振生物芯片，并利用该芯片快速定性定量检测目标物的方法。该方法选用特定尺寸结构的纳米等离子共振生物芯片(以下简称芯片)，利用酶标二抗与TMB溶液反应产生的TMB离子，与生物芯片表面的贵金属(Ag、Au)发生刻蚀反应，从而导致吸收全光谱的光谱峰OD值产生明显的下降，进而实现目标物的快速定性定量检测；本专利技术的检测方法的技术原理完全不同于上述现有技术。具体通过以下技术实现。
[0009]基于夹心ELISA的纳米等离子共振生物芯片，包括基片和修饰在所述基片上的包被抗体；所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为1
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20nm钛膜层、2
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80nm银膜层和2
‑
70nm金膜层，或者包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为1
‑
20nm钛膜层、2
‑
70nm银膜层，所述包被抗体用于与目标物特异结合；所述基底表面压印矩阵排列的纳米孔。。
[0010]上述NanoSPR生物芯片的基片，是采用目前公知的制备方法制备而成，即首先利用激光干涉光刻在硅晶圆纳米柱模具上制作纳米杯阵列，然后将紫外光固化聚合物溶液涂覆在清洁的硅晶圆纳米柱模具上，采用匀胶仪使表面的胶溶液均匀铺展，再将聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄板缓慢贴合于覆盖有紫外光固化聚合物的纳米柱模具上，使之于模具完全贴合，置于紫外线下进行固化处理；接着将PET薄板连同带有纳米杯阵列的紫外光固化聚合物从模具上剥离，即得到基底；最后在纳米杯阵列表面依次蒸镀钛膜、银膜、金膜，即得到NanoSPR生物芯片的基片。
[0011]如上所述，本专利技术提供的NanoSPR生物芯片的基片具有两种结构形式，即一种结构为基底+钛膜层(1
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20nm)+银膜层(2
‑
80nm)+金膜层(2
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70nm)，另一种结构为基底+钛膜层(1
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20nm)+银膜层(2
‑
70nm)，使用这两种结构形式的基片制备的SPR芯片，都能获得比较准确的定量检测结果，检测限较低。各类目标物标准品及其包被抗体均可以市场采购获得。
[0012]上述纳米等离子共振生物芯片(NanoSPR生物芯片)能够用于检测所有具有特异性抗体和二抗的抗原或化学物质(即目标物)，例如可以广泛应用于肿瘤标志物(甲胎蛋白AFP、前列腺特异抗原PSA、癌胚抗原CEA等)、动物疾病(非洲猪瘟病毒、禽流感病毒、猪瘟病毒抗体、猪禽流感、犬细小、犬瘟、猫瘟抗体等等)、食品中的小分子物质(抗生素类、毒素类、氟虫腈、黄曲霉素、额外添加物类等)的快速定性定量检测中。
[0013]优选地，所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为2
‑
9nm钛膜层、5
‑
30nm银膜层、2
‑
10nm金膜层；进一步优选地，所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为2
‑
5nm钛膜层、5
‑
10nm银膜层、2
‑
5nm金膜层。
[0014]优选地，所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为2
‑
9nm钛膜层、5
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30nm银膜层。进一步优选地，所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为2
‑
5nm钛膜层、5
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于夹心ELISA的纳米等离子共振生物芯片，其特征在于，包括基片和修饰在所述基片上的包被抗体；所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为1
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20nm钛膜层、2
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80nm银膜层和2
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70nm金膜层，或者包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为1
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20nm钛膜层、2
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70nm银膜层，所述包被抗体用于与目标物特异结合；所述基底表面压印矩阵排列的纳米孔。2.根据权利要求1所述的基于夹心ELISA的纳米等离子共振生物芯片，其特征在于，所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为2
‑
9nm钛膜层、5
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30nm银膜层、2
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10nm金膜层。3.根据权利要求1所述的基于夹心ELISA的纳米等离子共振生物芯片，其特征在于，所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为2
‑
9nm钛膜层、5
‑
30nm银膜层。4.一种权利要求1
‑
3任一项所述的基于夹心ELISA的纳米等离子共振生物芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备、清洗所述基片，使用CBS缓冲液稀释包被抗体，获得包被抗体工作液，取包被抗体工作液包被所述基片，4
‑
37℃孵育2
‑
24h；S2、用PBST缓冲液洗板、拍板，加入150μl封闭剂，25
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37℃孵育30
‑
120min；S3、然后加入150μl保护剂，25
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37℃孵育1
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60min，烘干去除保护剂，制成所述纳米等离子共振生物芯片。5.一种芯片微孔板，其特征在于，集成了权利要求1
‑
3任一项所述的纳米等离子共...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽萍，李睿，刘钢，樊洪利，周翰霖，
申请(专利权)人：量准武汉生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：