一种基于DNA步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器及其应用，涉及生物传感器领域。所述甲基转移酶传感器包括识别探针、DNA步行器和超支化滚环扩增体系；所述识别探针包括H

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器及其应用


[0001]本专利技术涉及生物传感器领域，特别是涉及一种基于DNA步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器及其应用。

技术介绍

[0002]DNA甲基化涉及甲基基团从S
‑
腺苷
‑
L
‑
甲硫氨酸(SAM)转移到胞嘧啶的C
‑
5位或腺嘌呤的N6位，在真核生物和原核生物的基因组印迹、基因表达和细胞发育中发挥重要作用。DNA甲基化修饰作为调控基因表达的一种重要方式，由DNA甲基转移酶催化完成，在细菌的生长形态以及生理代谢等方面都发挥着重要的作用，从而增加细菌在多变环境中的生存力。因此，开发一种灵敏、准确的DNA甲基转移酶活性检测方法对细菌生长形态和耐药性的研究是非常必要的。
[0003]迄今为止，已经开发了多种方法用于DNA甲基转移酶测定，如高效液相色谱、质谱、微阵列、比色检测、荧光检测、电化学检测、电化学发光法和放射性[3H]标记的S
‑
腺苷
‑
甲硫氨酸测定。其中，荧光检测法具有成本低、操作相对简单、响应速度快、重复性和一致性好等优点，在DNA甲基转移酶检测中具有较高的应用价值。然而，这些荧光传感器的灵敏度不足，准确的DNA甲基转移酶活性测定可能需要建立更灵敏的扩增策略。因此，在甲基转移酶测定中应用了许多信号放大策略，以实现更高的检测灵敏度，包括实时荧光定量PCR、杂交链式反应(HCR)、催化发夹组装(CHA)和滚环扩增(RCA)。在这些扩增策略中，实时荧光定量PCR因其高可用性和通用性而被认为是最成功的一种。然而，PCR需要复杂的热循环步骤、复杂的设备和较长的操作时间。与PCR相比，HCR和CHA是代表性的等温非酶DNA扩增，其操作过程快捷方便。但由于多个发夹结构倾向于彼此杂交，所以HCR和CHA的生物传感器会受到高背景信号的影响，RCA作为新一代DNA等温扩增技术，由于其高效、简便，已被用于构建生物传感器。然而，RCA的扩增效率受到限制，基于RCA的传感器的灵敏度低于PCR。为了提高RCA的灵敏度，可以通过引入与RCA产物互补的第二个引物将线性RCA(LRCA)转化为超支化滚圈扩增(HRCA)，该引物具有比LRCA高得多的扩增效率(高达109倍)。该方法已成功应用于构建多种不同目标的生物传感器。例如，福州大学林振宇的团队通过甲基化敏感裂解引物和HRCA开发了一种无标记的Dam甲基转移酶生物传感器(检测极限＝1.8U/mL)。该传感器的检出限较高，灵敏度与无酶传感器传感器相比有较大差距。
[0004]DNA步行器是一种新型的分子机器，它可以沿着预先定义的DNA轨迹行走。它已广泛应用于生物传感器、药物输送和生物计算。DNA步行器可以在短时间内完成底物的快速释放，从而实现高效的显著信号增强。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种基于DNA步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术通过使用DNA步行器
‑
HRCA策略，实现了
甲基转移酶的高灵敏度检测。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种基于DNA步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器，所述甲基转移酶传感器包括识别探针、DNA步行器和超支化滚环扩增体系；所述识别探针包括H
M
识别探针和/或H
D
识别探针，所述H
M
识别探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述H
D
识别探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]进一步地，所述超支化滚环扩增体系包括phi29DNA聚合酶、引物1、引物2和dNTP；所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0009]本专利技术还提供上述的甲基转移酶传感器在制备检测甲基转移酶的试剂盒中的应用。
[0010]本专利技术还提供一种检测甲基转移酶的试剂盒，包含上述的甲基转移酶传感器。
[0011]进一步地，所述试剂盒还包括Padlock探针，所述Padlock探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0012]进一步地，所述试剂盒还包括功能化磁珠，所述功能化磁珠的制备方法包括：将生物素修饰的DNAzyme和阻断剂在Tris
‑
HCl缓冲液中混合，反应后形成DNAzyme阻断剂双链，随后，将链霉亲和素磁珠分散在Tris
‑
HCl缓冲液，之后加入所述DNAzyme阻断剂双链，反应后得到所述功能化磁珠；
[0013]所述DNAzyme的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述阻断剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0014]本专利技术还提供上述的甲基转移酶传感器或试剂盒在甲基转移酶检测中的应用。
[0015]本专利技术还提供一种检测甲基转移酶的方法，包括利用上述的甲基转移酶传感器或试剂盒进行甲基转移酶检测的步骤。
[0016]进一步地，当所述甲基转移酶为M.SssI甲基转移酶时，所述方法包括：使用上述的甲基转移酶传感器中的H
M
识别探针，通过M.SssI甲基转移酶和HpaII核酸内切酶的相互作用，引发DNA步行器和超支化滚环扩增反应，通过定量荧光信号强度实现对M.SssI甲基转移酶的含量检测。
[0017]进一步地，当所述甲基转移酶为Dam甲基转移酶时，所述方法包括：使用上述的甲基转移酶传感器中的H
D
识别探针，通过Dam甲基转移酶和DpnI核酸内切酶的相互作用，引发DNA步行器和超支化滚环扩增反应，通过定量荧光信号强度实现对Dam甲基转移酶的含量检测。
[0018]本专利技术公开了以下技术效果：
[0019]本专利技术创新性地将DNA步行器引入HRCA传感系统，以构建新型M.SssI甲基转移酶生物传感器。该生物传感器可以集成DNA步行器和HRCA，从而避免使用多个发夹自组装并导致低背景信号。在没有M.SssI甲基转移酶的情况下，发夹H
M
被HpaII核酸内切酶切割，从而产生称为T
‑
DNA的DNA片段。T
‑
DNA可以触发链置换反应，释放Pb
2+
依赖的DNA酶。随后，DNA步行器通过切割基底逐渐在磁珠表面行走，从而产生大量ssDNA探针(c
‑
DNA)。然后，释放的c
‑
DNA触发了随后的HRCA反应，产生了大量不同长度的dsDNA。SYBR Green I被嵌入dsDNA的凹槽中，产生显著的荧光信号。在M.SssI甲基转移酶的存在下，发夹H
M
被甲基化，无法被核酸
内切酶切割。随后的DNA步行器
‑
HRCA反应未启动，荧光信号保持在低水平。由于DNA步行器和HRCA的双重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA步行器和超支化滚环扩增的甲基转移酶传感器，其特征在于，所述甲基转移酶传感器包括识别探针、DNA步行器和超支化滚环扩增体系；所述识别探针包括H
M
识别探针和/或H
D
识别探针，所述H
M
识别探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述H
D
识别探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的甲基转移酶传感器，其特征在于，所述超支化滚环扩增体系包括phi29 DNA聚合酶、引物1、引物2和dNTP；所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。3.一种如权利要求1或2所述的甲基转移酶传感器在制备检测甲基转移酶的试剂盒中的应用。4.一种检测甲基转移酶的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的甲基转移酶传感器。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Padlock探针，所述Padlock探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括功能化磁珠，所述功能化磁珠的制备方法包括：将生物素修饰的DNAzyme和阻断剂在Tris
‑
HCl缓冲液中混合，反应后形成DNAzyme阻断剂双链，随后，将链霉亲和素...

【专利技术属性】
技术研发人员：张思奇，施伟，厉凯彬，韩得满，
申请(专利权)人：台州学院，
类型：发明
国别省市：