核酸检测方法及检测反应器技术

本发明专利技术提供了一种核酸检测方法及检测反应器，所述方法包括以下步骤：S1、制备反应体系和样本保存液并加入反应器中；S2、取待测样本加入样本保存液中成样本液；S3、样本液通过外力压入反应体系；S4、将反应体系进行扩增反应读取反应结果，检测结果通过比色或荧光判定。反应器包括加样部、样本部和反应部，加样部和样本部之间、样本部和反应部之间活动连接实现密封状态，加样部为活塞结构，反应部与样本部连接处设有微孔且微孔孔径不大于样本液或样本保存液的毛细长度；加样部通过外力向反应部运动实现密封状态下样本液穿过微孔压入反应部内。本发明专利技术反应过程无需开盖，无需多次加液，可实现整个核酸检测无需PCR实验室，无气溶胶污染。污染。污染。

【技术实现步骤摘要】
核酸检测方法及检测反应器


[0001]本专利技术涉及核酸检测(DNA或RNA)
，具体涉及一种核酸检测方法及检测反应器。

技术介绍

[0002]核酸检测作为一种具有高灵敏度及特异性的方法，目前已经广泛应用于许多领域，例如疾病诊断，食品安全，传染病防治等。用简单方式对特定核酸序列进行检测，可以赋予现场护理(point
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of
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care)诊断和现场病原体检测更大的价值。
[0003]PCR(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。然而，PCR作为经典的核酸检测方法，其固有的变性
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复性
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延伸循环，要求其必须需要热循环仪设备作为支撑，同时因为气溶胶污染问题，专业实验室也成为了必须要条件之一。目前，PCR延展技术平台，特别是定量PCR(qPCR)方法，是最广泛使用的病原体检测方法，并且被认为是新的金标准测试。qPCR提供短得多的样品到结果(sample
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to
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result)的时间(3到5小时)。然而，尽管qPCR被广泛接受，但它因依赖标准参考物质(标准曲线)进行定量而受到限制。不可靠和不一致的商业标准参考物质也可能影响qPCR定量的准确度。此外，qPCR易于受到由环境样品中自然存在的物质(例如，重金属和有机质)引起的抑制，从而导致靶定量不准确或假阴性结果。因而极大地限制了PCR在床旁快速诊断(POCT)和现场快速检测等领域的应用。与qPCR相比，最近的数字PCR技术已被证明是用于环境样品中的微生物病原体检测的更稳健的解决方案。数字PCR基于分区(partitioning)和泊松统计，因此，不需要比较外部定量标准来对未知浓度的样品定量。然而，将数字PCR方法实施于使用点应用(point
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use application)可能是挑战性的。这是因为数字PCR需要昂贵的仪器(即Bio
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rad液滴数字PCR)、设备齐全的实验室环境和训练有素的技术人员来进行测定。这些因素严重限制数字PCR在资源有限背景下的可及性和应用。
[0004]为了克服这些缺点，一大类等温核酸扩增的新方法大量出现，其中LAMP是最受关注也是最有应有前景的一种方法。
[0005]环介导等温扩增技术(loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代PCR核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60
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65℃恒温扩增，15
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60分钟左右即可实现109～10
10
倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。LAMP作为一种分子生物学检测技术，具有高特异性、高敏感性、简单、便捷及成本低的特点，已广泛用于临床疾病的诊断、流行性细菌或病毒的定性定量检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片。
[0006]因此，LAMP被期望用于检测微生物的快速、简化、低成本的测定，以在集中式实验室之外，例如，在需要对资源有限的地方的环境水进行现场使用点测试的情况下提供分子测定。
[0007]LAMP检测在等温条件下进行，等温条件可以维持在不同的仪器中，例如热循环仪和水浴，或者本文采用的LAMP检测装置。该设备使得能够通过加热装置内部的检测室来扩增样品的DNA/cDNA，以检测病原体。
[0008]在本申请提及的设备上开发的检测中，概而言之，将分析中的生物样品的等分试样添加到试剂中，并将该集合(set)在LAMP检测室中加热。然后在检测过程中监测这些样品，以识别可能的颜色变化(例如，在使用羟萘酚蓝试剂时从紫色变为天蓝色)，该颜色变化表示样品相对于所用试剂的阳性反应。根据现有技术已知LAMP检测室的各种构造，并且会在以下段落中描述所述构造。
[0009]Wang,TT发表在“Journal of microbiological methods”上的文章“A novel CMOS image sensor system for quantitative loop
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mediated isothermal amplification assays to detect food
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borne pathogens(用于定量环介导等温扩增测定以检测食源性病原体的新型CMOS图像传感器系统)”提出了用于LAM检测的低成本CMOS图像传感器系统，来检测食源性病原体。所描述的系统实时监测扩增过程中的颜色变化引起的光子变化。该文章最后指出，简单、紧凑、低成本且低能耗的设计，代表了用于现场诊断的便携式、灵敏、易于使用、实时定量分析工具发展中的重大进步。
[0010]Ahmed,ME发表在“BMC Veterinary Research”上的文章“Development and evaluation of real
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time loop
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mediated isothermal amplification assay for rapid detection of cystic echinococcosis(开发和评估快速检测囊性包虫病的实时环介导等温扩增测定)”描述了用于快速检测囊性包虫病的实时LMAP检测的开发和评估。所述检测在恒定温度(63℃)下进行，使用扩增和检测仪器以及荧光染料进行实时监测。在水浴中进行扩增循环后，用肉眼观察LAMP产物以检测颜色变化，并在UV光源下使该产物可视化。
[0011]Sayad,AA发布在“Sensors And Actuators B
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Chemical”上的文章”A microfluidic lab
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on
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a
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disc integrated loop mediated isothermal amplification for foodborne pathogen detection(用于食源性病原体检测的微流体盘上集成环介导等温扩增)”报道了用于检测食物病原体的LAMP扩增离心微流体装置，其中，使用强制对流加热源来驱动蜡阀和温度加热，以进行LAMP扩增。
[0012]文献WO2013043203涉及用于等温和非等温核酸的LAMP测定的容器，该容器包括主体，其除了具有主体开口端和通过通道延伸的柔性材料的插入式盖(plug
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in lid)之外，还具有内/外表面和开口端。根据该文献，与已知的微流控芯片相比，已开发的容器保证了更大的灵活性，这是由于其处理小体积和大体积流体的固有灵活性所致。另一个突出的优点是，所揭露的容器还可以提取样品并具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.核酸检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1、制备检测试剂：根据待测物选择扩增方法且适应性地设计检测试剂；配置检测试剂后并将检测试剂预加入反应器中；检测试剂包括反应体系和样本保存液，且反应体系和样本保存液分别独立地内置于同一反应器内；S2、取待测样本并加入样本保存液中成样本液，其中，所述样本为可获取核酸的样本来源；S3、加入样本液，样本液通过外力压入反应体系中，样本液加入量小于100微升；S4、将反应体系进行扩增反应并读取反应结果完成检测，检测结果通过比色或荧光判定；其中：所述扩增反应为变温扩增反应或等温扩增反应；所述反应体系为10
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200微升，反应体系至少包括：反应酶、引物、dNTP、Buffer和染料；根据待测核酸适应性地设计特异性引物序列；所述样本选自：鼻咽分泌物、肠道分泌物、呼吸道分泌物、生殖道分泌物或血液样本。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当待测核酸为RNA时，反应酶包括RNA
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逆转录酶；且当等温扩增反应时，反应酶还包括BST聚合酶；或当变温扩增反应时，反应酶还包括Taq聚合酶；或当待测核酸为DNA时，等温扩增反应体系反应酶包括BST聚合酶，变温扩增体系反应酶包括Taq聚合酶。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：染料为显色染料或荧光染料。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述显色染料选自以下的一种或几种的组合：HNB、中性红染料、钙黄素、酸性铬蓝K、钼酸铵或可见光染料；或所述荧光染料选自以下的一种或几种的组合：SYBR Green、SYBR Gold、SYBR
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safe、EvaGreen、RTGreen、SYTO
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9、Gel Green、Gel Red、EB染料或Gold View I染料。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：取样方式为拭子取样；取样后将带有核酸的拭子放入已加有样本保存液的反应管中成样本液。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S1中所述反应体系为冻干状态。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S1中反应器内反应酶、引物和dNTP中至少一个组分与另外二个组分通过遇热可融的封隔层独立地分别加入所述反应器的同一腔内。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述封隔层的熔点为50～70℃，且凝固点为0～40℃。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：S4加热后所述封隔层融解后反应体系成反应液状态并进行扩增反应。10.根据权利要求8...

【专利技术属性】
技术研发人员：岂源，
申请(专利权)人：北京清风堂医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：