一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，本发明专利技术公开的针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的核酸提取方法，首次提出利用乳酸链球菌素Nisin对MRSA进行裂解，即对培养后的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌采用乳酸链球菌素进行孵育处理，再使用常规的DNA提取操作，例如利用现成的市售试剂盒进行基因组DNA提取，实验数据显示，经Nisin提前预处理后，可以显著提高MRSA的基因组DNA提取效率。本发明专利技术方法提取的基因组DNA纯度高、浓度大，能满足特定基因的鉴定和测序等研究的要求，而且省时高效，成本低，操作简单。操作简单。操作简单。

【技术实现步骤摘要】
一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法


[0001]本专利技术属于微生物基因组提取
，具体涉及一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法。

技术介绍

[0002]需氧革兰阳性球菌是细菌性感染的重要病原菌，其中包括葡萄球菌属、肺炎链球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌等链球菌属、肠球菌属等细菌，且感染率逐年增加，约占全部细菌感染的40％。在医院获得性血流感染中，凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌分别居前三。近年来革兰阳性球菌耐药性的日趋严重，特别是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA。无论是用于致病微生物检测的分子诊断技术，还是用于细菌分子生物学研究的转录组研究技术，其第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸(包括RNA和DNA)的提取，这直接影响着这些检测技术的结果。金黄色葡萄球菌为革兰阳性细菌，细胞壁较厚难于破裂，90％以上金黄色葡萄球菌含有葡萄球菌蛋白A；有些金黄色葡萄球菌本身还分泌一种耐热耐核酸酶的蛋白质可以降解核酸，因此在其核酸提取方面，效果一直不很理想。
[0003]目前，革兰氏阳性菌的核酸提取主要采用裂解细胞后提取核酸的方法，其中常用机械破碎法和酶裂解法破坏细菌的细胞壁。机械破碎法如玻璃珠法、超声破碎等，其局限性在于需要额外的设备且破碎过程剧烈，可能造成基因组DNA的物理性断裂。酶裂解法则较为温和，溶菌酶(Lysozyme)是实验室最常用的用于提取革兰阳性细菌核酸的细胞壁水解酶，主要水解连接G+细菌细胞壁的N
‑
乙酰氨基葡萄糖和N
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乙酰胞壁酸之间的β
‑
1,4
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糖苷键。但是，由于金黄色葡萄球菌含有葡萄球菌蛋白A，与细胞壁中的肽聚糖共价交联，对溶菌酶的处理不敏感，因此裂解效果不明显。
[0004]由于MRSA基因组DNA的提取难度较大，目前市面上还有一种溶葡球菌酶(Lysostaphin)产品。溶葡球菌酶是一种肽链内切酶，其作用机制是裂解葡萄球菌细胞壁肽聚糖中的甘氨酸五肽交联桥，进而破坏细胞壁的完整性并溶解菌体，提高金葡菌基因组DNA的提取率。但溶葡球菌酶有两方面的局限性，一方面，已有研究报道由于细菌细胞壁的肽聚糖交联桥的结构改变，出现了对该酶抗性的金黄色葡萄球菌株。另一方面溶葡球菌酶售价较高(600
‑
800元/mg，单次提取约花费3
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4元)。这些试剂盒的价格昂贵，操作步骤繁琐，并且提取效果也并不理想。因此，如何从MRSA中高效、快捷的提取核酸，已成为了目前分子诊断技术和转录组研究等技术推广和应用的一个瓶颈。
[0005]乳酸链球菌素(nisin)是一种细菌肽，由乳球菌属和链球菌属的一组革兰氏阳性菌所产生，可作用于细菌的细胞壁、细胞膜，表现出对细胞壁、细胞膜的破坏作用，抑制引起食品腐败和人体感染的绝大多数革兰氏阳性菌。目前，nisin主要应用于食品防腐以及抑菌研究，还没有研究人员对Nisin作为革兰氏阳性病原菌的核酸提取试剂进行过研究报道。

技术实现思路

[0006]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，能够解决现有的提取方法所用酶易产生耐药且价格高昂、提取操作复杂导致提取效率不高的技术问题。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0008]本专利技术公开的一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，包括以下步骤：
[0009]1)在培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的液体培养基中加入乳酸链球菌素，进行孵育，离心去除上清，收集菌体沉淀；
[0010]2)采用DNA提取试剂盒，对菌体沉淀进行裂解，去除RNA与蛋白质，获得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA。
[0011]优选地，步骤1)中，是将MRSA接种至胰蛋白胨大豆肉汤培养基TSB液体培养基中，37℃，200rpm，摇床震荡过夜培养。
[0012]优选地，所述乳酸链球菌素为市售生物类级别试剂，活性>1000000IU/g。
[0013]进一步优选地，乳酸链球菌素的用量为：每2～3mL液体培养基中加入无菌乳酸链球菌素溶液至乳的酸链球菌素终浓度为1mg/mL。
[0014]更进一步优选地，所述无菌乳酸链球菌素溶液的配制方法如下：取乳酸链球菌素50mg，加入1mL pH值为2的盐酸溶液，涡旋溶解后，2500rpm离心处理1min，上清液经0.22μm过滤器过滤除菌，得到50mg/mL的无菌乳酸链球菌素溶液。
[0015]优选地，步骤1)中，在过夜培养的MRSA液体培养物中加入乳酸链球菌素Nisin，混匀，37℃培养箱静置孵育1
‑
2h，孵育结束后，离心去上清。
[0016]优选地，步骤2)中，采用试剂盒中的裂解液和蛋白酶K对菌体沉淀进行裂解处理，去除蛋白；采用试剂盒中的RNase A继续处理，去除RNA。
[0017]进一步优选地，对菌体沉淀按照常规细菌DNA提取步骤，或采用常规市售细菌DNA提取试剂盒进行提取即可，包括细胞沉淀重悬、裂解、去除RNA和蛋白质、沉淀获得基因组DNA。
[0018]更进一步优选地，具体操作为：向2
‑
3ml培养液中加入无菌乳酸链球菌素(Nisin)溶液至终浓度为1mg/ml，37℃孵育1h，孵育完成后，离心去上清，加入100μL TE缓冲液，振荡混匀；加入100μL基因组提取试剂盒中的裂解液和20μL蛋白酶K，振荡混匀，55℃孵育0.5h，此步骤为彻底裂解细胞，并除去蛋白；加入5μL RNase A，轻柔颠倒混匀，室温放置5min；10000g离心2min，转移上清至新的EP管，给去除了RNA和蛋白质的上清中加入2倍体积的冷的无水乙醇，轻柔混匀EP管，可见丝状悬浮沉淀为基因组DNA；10000g离心2min收集沉淀，并用70％预冷的乙醇洗涤沉淀。沉淀在超净台中晾干，溶解于50μL无菌水或TE缓冲液中。
[0019]更进一步地，所述蛋白酶K为试剂盒中提供，属于市售可得产品。去除裂解后体系中的RNA与蛋白质，可以提高基因组的纯度。
[0020]本专利技术还公开了乳酸链球菌素作为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA提取增效剂的应用。
[0021]本专利技术还公开了乳酸链球菌素在制备用于提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的试剂盒中的应用。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0023]本专利技术公开的针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的核酸提取方法，首次提出利用乳酸链球菌素Nisin对MRSA进行裂解，即对培养后的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌采用乳酸链球菌素进行孵育处理，再使用常规的DNA提取操作，例如利用现成的市售试剂盒进行基因组DNA提取，实验数据显示，经Nisin提前预处理后，可以显著提高MRSA的基因组DNA提取效率。本专利技术方法提取的基因组DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的液体培养基中加入乳酸链球菌素，进行孵育，离心去除上清，收集菌体沉淀；2)采用DNA提取试剂盒，对菌体沉淀进行裂解，去除RNA与蛋白质，获得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA。2.根据权利要求1所述的采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述乳酸链球菌素为市售生物类级别试剂，活性>1000000IU/g。3.根据权利要求1所述的采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，其特征在于，乳酸链球菌素的用量为：每2～3mL液体培养基中加入无菌乳酸链球菌素溶液至乳的酸链球菌素终浓度为1mg/mL。4.根据权利要求3所述的采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，其特征在于，所述无菌乳酸链球菌素溶液的配制方法如下：取乳酸链球菌素50mg，加入1mL pH值为2的盐酸溶液，涡旋溶解后，250...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩蓓，马天有，韩蕾，马鑫鑫，程悦，吕佳，刘丽娟，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：