去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体及其编码基因与应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体氨基酸序列以SEQ ID NO.1为参考，具有位于第72位苏氨酸T72、第92位甘氨酸G92中的至少一个突变；第72位苏氨酸突变为除其自身以外任意一种天然氨基酸，第92位甘氨酸突变为除其自身以外任意一种天然氨基酸。本发明专利技术通过对棒状链霉菌的去乙酰氧基头孢菌素C合成酶进行定点突变和基因工程改造，提高了该酶对青霉素G的催化活性，并且可提高产黄支顶孢霉头孢菌素C的产量，适于商业和工业应用。适于商业和工业应用。适于商业和工业应用。

【技术实现步骤摘要】
去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体及其编码基因与应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体及其编码基因与应用。

技术介绍

[0002]去乙酰氧基头孢菌素C合成酶(Deacetoxycephalosporin C synthase，DAOCS)是β
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内酰胺类抗生素生物合成过程中的关键酶，其催化五元噻唑环扩环生成六元噻嗪环，从而得到相应的β
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内酰胺类代谢产物。
[0003]头孢菌素C(CPC)是丝状真菌产黄支顶孢霉产生的一种重要的天然β
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内酰胺类抗生素。在产黄支顶孢霉基因组上存在编码双功能酶——去乙酰氧基头孢菌素C合成酶(扩环酶)/去乙酰基头孢菌素C合成酶(羟化酶)(Deacetoxycephalosporin/deacetylcephalosporin C synthase，DAOC/DACS)的cefEF基因，是产黄支顶孢霉合成CPC的限速酶，催化青霉素N(penicillin N，PeN)发生扩环反应生成去乙氧基头孢菌素C(DAOC)，然后催化DAOC发生羟基化反应生成去乙酰基头孢菌素C(DACS)。CPC和Pen N是产黄支顶孢霉所分泌的主要天然产物，在CPC发酵生产过程中，产黄支顶孢霉还会同时分泌大量的Pen N；这两种化合物的分泌取决于他们在细胞水平上的生物合成；因此，提升产黄支顶孢霉扩环酶酶活可能有利于副产物Pen N向产物CPC的转化。
[0004]另外，7
‑
氨基r/>‑3‑
去乙酰氧基头孢烷酸(7
‑
ADCA)是生产口服头孢类药物的重要中间体原料，主要用于合成头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄等抗生素。以青霉素G钾盐为原料化学合成7
‑
ADCA是目前在工业生产中普遍采用的方法，然而其合成过程中需要多步化学扩环，反应条件要求高、各步反应产物收率低、生产结束化学污染较重，因此，人们试图用无污染且更经济的酶转化方法来实现头孢菌素母核的合成。青霉素G产量大、价格低，相对有效的方式是利用去乙酰氧基头孢菌素C合成酶，即青霉素扩环酶使青霉素G扩环得到G
‑7‑
ADCA(7
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苯乙酰基脱乙酰氧基头孢菌素C)，再去除其7位侧链得到7
‑
ADCA。然而，野生型DAOCS的天然底物是目前尚无法大规模工业合成的青霉素N(penicillin N，PeN)；该酶对于大量存在的非天然底物青霉素G的反应活性很低，因此实际转化率也很低，限制了去乙酰氧基头孢菌素C合成酶在工业生产上的应用。所以，对DAOCS进行酶学改造，增强其对大量廉价青霉素G的催化活性，增强其反应稳定性，成为将其引入工业化生产必须解决的首要问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术公开了去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体及其编码基因与应用，通过对棒状链霉菌中的去乙酰氧基头孢菌素C合成酶进行定点突变可提高酶的催化活性，进而有利于β
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内酰胺类抗生素的合成和转化。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体，该突变体的氨基酸序列以SEQ ID NO.1(野生型去乙酰氧基头孢菌素C合成酶)为参考：MDTTVPTFSLAELQQGLHQDEFRRCLRDKGLFYLTDCGL
TDTELKSAKDLVIDFFEHGSEAEKRAVTSPVPTMRRGFTGLESESTAQITNTGSYSDYSMCYSMGTADNLFPSGDFERIWTQYFDRQYTASRAVAREVLRATGTEPDGGVEAFLDCEPLLRFRYFPQVPEHRSAEEQPLRMAPHYDLSMVTLIQQTPCANGFVSLQAEVGGAFTDLPYRPDAVLVFCGAIATLVTGGQVKAPRHHVAAPRRDQIAGSSRTSSVFFLRPNADFTFSVPLARECGFDVSLDGETATFQDWIGGNYVNIRRTSKA；具有位于第72位苏氨酸T72、第92位甘氨酸G92中的至少一个突变；第72位苏氨酸突变为除其自身以外任意一种天然氨基酸，第92位甘氨酸突变为除其自身以外任意一种天然氨基酸。
[0008]进一步地，编码野生型去乙酰氧基头孢菌素C合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：atggacacgacggtgcccaccttcagcctggccgaactccagcagggcctgcaccaggacgagttccgcaggtgtctgagggacaagggcctcttctatctgacggactgcggtctgaccgacaccgagctgaagtcggccaaggacctcgtcatcgacttcttcgagcacggcagcgaggcggagaagcgcgccgtcacctcgcccgtccccaccatgcgccgcggcttcaccgggctggagtcggagagcaccgcccagatcaccaataccggcagctactccgactactcgatgtgctactcgatgggcaccgcggacaacctcttcccgtccggtgacttcgagcggatctggacccagtacttcgaccgccagtacaccgcctcccgcgcggtcgcccgggaggtcctgcgggcgaccgggaccgagcccgacggcggggtcgaggccttcctcgactgcgagccgctgctgcggttccgctacttcccgcaggtccccgagcaccgcagcgccgaggagcagcccctgcggatggcgccgcactacgacctgtcgatggtcaccctcatccagcagacaccctgcgccaacggcttcgtcagcctccaggccgaggtcggcggcgcgttcacggacctgccctaccgtccggacgccgtcctcgtcttctgcggcgccatcgcgaccctggtgaccggcggccaggtcaaggccccccggcaccatgtcgcggccccccgcagggaccagatagcgggcagcagccgcacctccagtgtgttcttcctccgtcccaacgcggacttcaccttctccgtcccgctggcgcgcgagtgcggcttcgatgtcagcctggacggcgagaccgccacgttccaggattggatcgggggcaactacgtgaacatccgccgcacatccaaggcatag。
[0009]进一步地，去乙酰氧基头孢菌素C合成酶单位点突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：MDTTVPTFSLAELQQGLHQDEFRRCLRDKGLFYLTDCGLTDTELKSAKDLVIDFFEHGSEAEKRAVTSPVPXMRRGFTGLESESTAQITNTGSYSDYSMCYSMGTADNLFPSGDFERIWT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列以SEQ ID NO.1为参考，具有位于第72位苏氨酸T72、第92位甘氨酸G92中的至少一个突变；第72位苏氨酸突变为除其自身以外任意一种天然氨基酸，第92位甘氨酸突变为除其自身以外任意一种天然氨基酸。2.根据权利要求1所述的去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列以SEQ ID NO.1为参考，第72位苏氨酸突变为色氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸、亮氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸或蛋氨酸。3.根据权利要求1所述的去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列以SEQ ID NO.1为参考，第92位甘氨酸突变为蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或组氨酸。4.根据权利要求1所述的去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列以SEQ ID NO.1为参考，第72位苏氨酸突变为色氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸、异亮氨酸或组氨酸；第92位甘氨酸突变为蛋氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁恒宇，周鹏，韩超，陈民良，幸志伟，张皓，赵振华，张敏，李雪亮，
申请(专利权)人：河南省健康元生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：