褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsRNA制造技术

本发明专利技术公开了一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因，如SEQ ID NO:3所示；还公开了褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA，其序列如SEQ ID NO:6所示；还公开了dsRNA的合成方法：提取褐色橘蚜的总RNA，反转录成为cDNA作为扩增模板，以序列为SEQ ID NO:4的上游引物和以序列为SEQ ID NO:5的下游引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行电泳后回收产物，以胶回收产物为模板合成得到褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的dsRNA。本发明专利技术首次鉴定得到褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因序列，提供的dsRNA基因沉默效率高，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsRNA


[0001]本专利技术涉及昆虫的生长发育调控和基因工程
，特别涉及一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因及其dsRNA。

技术介绍

[0002]褐色橘蚜Aphis citricidus是柑桔衰退病病毒Citrus tristeza virus的主要传播媒介，该病毒对世界柑桔产业造成严重的经济损失。褐色橘蚜应对逆境胁迫时出现典型的翅型可塑性，如：拥挤条件下，褐色橘蚜分化出有翅型，正常条件下褐色橘蚜为无翅型。翅型可塑性作为褐色橘蚜重要的生态对策与其爆发成灾及传播植物病毒密切相关。褐色橘蚜田间营孤雌生殖、加之有翅率高(约20％)、翅型可塑性强，世代历期短、繁殖率高等特点，使用化学药剂防治较为困难并且极易引起抗药性等问题(Shilts et al.,2018；Gao et al.,2021)。阐明褐色橘蚜翅型可塑性的分子调控机制，探索蚜虫防控的新靶标、寻获新型高效的蚜虫绿色防控技术是国内外的重大科技需求。
[0003]RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA，Double
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stranded RNA，双链核糖核酸)诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。
[0004]β
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胡萝卜素调控昆虫黑化、视觉体色、抗逆胁迫等重要生理进程(Heath et al.,2013；Tougeron et al.,2021)。β
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胡萝卜素是昆虫体内含量最高的类胡萝卜素(含40碳的碳氢化合物和氧化衍生物)(Ding et al.,2020；Maoka,2020)。β
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胡萝卜素参与粉纹夜蛾Trichoplusia ni的黑化反应，并调节其生长速率(Clark and Lampert,2018)。此外，β
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胡萝卜素通过酶催化作用转变成维生素A，并调控昆虫的视觉功能，缺乏β
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胡萝卜素会导致家蚕五龄幼虫单眼和成虫复眼对由光刺激产生的电反应能力丧失(Shimizu and Kato,1981)。β
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胡萝卜素响应逆境胁迫因子诱导昆虫体色可塑性(Tsuchida,2016；Wybouw et al.,2019；孙明霞等,2020)。豌豆蚜红色型与绿色型间β
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胡萝卜素含量差异较大，随着寄主营养条件变差，β
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胡萝卜素含量显著降低，种群适合度降低(Ding et al.,2020)；东亚飞蝗Locusta migratoria散居型呈现均匀绿色，群居型则呈现黑色背板和棕色腹面。进一步解析发现，飞蝗主要通过β
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胡萝卜素与其结合蛋白的分离与结合调控体色变化(Yang et al.,2019)。申请人前期研究发现，胰岛素信号通路调控褐色橘蚜翅可塑性(Ding et al.,2017)，并发现其上游调控因子miR
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9b(Shang et al.,2020)。
[0005]蚜虫通过真菌水平基因转移(Horizontal gene transfer)自身合成β
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胡萝卜素。研究发现，大多数昆虫不能从头合成β
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胡萝卜素，只能从食物中摄取或由体内共生微生物提供(Jeremy et al.,2013)。如家蚕Bombyx mori取食桑叶获得β
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胡萝卜素，色素物质被中肠吸收后先进入血液，随后透过丝腺被丝胶蛋白吸收，从而使蚕茧着色；烟粉虱Bemisia tabaci初级共生菌Candidatus Portiera aleyrodidarum基因组中包含β
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胡萝卜素生物合
成关键基因，调控自身和共生宿主β
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胡萝卜素的生物合成(Santos
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Garcia et al.,2012；Sloan and Moran,2012)。近年来研究发现，部分刺吸式昆虫(螨)通过水平基因转移从真菌中获得相关基因合成β
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胡萝卜素(Altincicek et al.,2012；Nov
á
kov
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and Moran,2012；Cobbs et al.,2013；Bryon et al.,2017)。在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum基因组中发现真菌水平转移的编码脱氢酶和合成/环化酶的基因，均是β
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胡萝卜素生物合成所必需的基因(Moran and Jarvik,2010)，该发现为昆虫β
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胡萝卜素生物合成与功能研究开辟了新领域。随后在其它蚜虫、二斑叶螨Tetranychus urticae和黑森瘿蚊Mayetiola destructor基因组中也发现了真菌转移β
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胡萝卜素生物合成相关基因的现象(Altincicek et al.,2012；Cobbs et al.,2013；Bryon et al.,2017)。
[0006]β
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胡萝卜素通路关键酶系在不同物种中差异巨大(Miziorko et al.,2011；Sun et al.,2018；Ma et al.,2022)。两个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)分子在合成酶的作用下生成八氢番茄红素。在植物、藻类和细菌中，该酶仅具有合成酶功能(Sieiro et al.,2003)。而在真菌中，合成酶为双功能酶，既具有合成酶功能，又具有环化酶功能(Velayos et al.,2000；Arrach et al.,2001)。八氢番茄红素在脱氢酶的作用下脱氢生成番茄红素。在真菌和真细菌中，这一过程由一个脱氢酶基因催化生成，而在植物和藻类生物中这一过程则由不同的酶系分工完成(Sandmann et al.,2009)。环化酶可使番茄红素的一端或者两端发生环化作用，生成β
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胡萝卜素、α
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胡萝卜素和γ
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胡萝卜素(Maoka et al.,2020)，β
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胡萝卜素则在加氧酶(NinaB)和β
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胡萝卜素结合蛋白(β
‑
CBP)的作用下形成复合物并进一步代谢成其他色素或能量物质(Clark et al.,2018；Chai et al.,2019；Yang et al.,2019)。分析34种蚜虫相关序列发现，脱氢酶、合成酶和环化酶基因是在蚜虫进化早期获得，经过不断的复制、重组和筛选，从而在不同种类的蚜虫中扩张或收缩出不同的基因，呈现多样化的β
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胡萝卜素通路(Nov
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kov
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and Moran,2012；Takemur本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。2.权利要求1所述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因或褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因编码的蛋白作为靶标在如下任一中的应用：1)在调控褐色橘蚜翅型可塑性或制备调控褐色橘蚜翅型可塑性的产品中的应用；2)在调控褐色橘蚜生长发育或制备调控褐色橘蚜生长发育调控剂中的应用；3)在防治褐色橘蚜或制备防治褐色橘蚜的产品中的应用。3.扩增权利要求1所述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的引物组，其特征在于：所述引物组的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.权利要求1所述的褐色橘蚜类胡萝卜素加氧酶基因的PCR扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：以褐色橘蚜总RNA反转录得到的cDNA为模板，以序列为SEQ ID NO:1的上游引物和以序列为SEQ ID NO:2的下游引物进行PCR扩增。5.如权利要求4所述的PCR扩增方法，其特征在于：当PCR扩增的反应体系为25μl时，25μl的PCR反应体系包括：浓度为200
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700ng/μl的cDNA模板1μl，浓度为0.15
‑
0.25μM的上下游引物各1μl，DNA聚合酶LA Taq MIX 0.25μl，10
×
Buffer(Mg
2+
plus)3μl，dNTP 4μl以及去核酸酶水14.75μl；PCR条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁碧月，王进军，尚峰，张永特，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：