CYP450基因在调控大豆异黄酮合成中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种CYP450基因在调控大豆异黄酮合成中的应用，该基因选自以下基因中的至少一种：CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因。所述CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因为内质网定位。所述CYP450基因的氨基酸序列包含K

【技术实现步骤摘要】
CYP450基因在调控大豆异黄酮合成中的应用


[0001]本专利技术涉及一种CYP450基因的应用，具体涉及CYP450基因在调控大豆异黄酮合成中的应用，属于基因工程应用


技术介绍

[0002]大豆是蝶形花亚科大豆属一年生的双子叶草本植物。大豆营养价值丰富，富含蛋白质、脂类物质、碳水化合物、维生素、矿物质以及多种生物活性物质等。大豆具有促进肠道健康、降血糖、降血脂、预防癌症和健脑益智等营养价值，常被人们加工成不同类型的豆制品以供食用。此外，大豆中的生物活性物质种类较多，主要包含异黄酮、皂苷、甾醇、磷脂等。异黄酮具有多种药理学特性，如抗氧化，消炎，抗病毒，抗癌，预防更年期、骨质疏松、心脑血管和糖尿病等疾病。异黄酮还是一种低分子量的抗菌化合物，对病原菌有着广谱的抑菌作用，可作为一种信号分子在植物与微生物分子的互作中起重要作用。
[0003]大豆异黄酮的主要成分为大豆苷元(Daidzein)，染料木素(Genistein)，黄豆黄素(Glycitein)以及三种苷元对应的葡萄糖苷、丙二酰基糖苷和乙酰基糖苷。但是，大豆异黄酮的生物合成途径还不够完善，其中大豆异黄酮末端的生物生成途径中的酶属于CYP450酶，但其编码的基因还不清楚，以及是否还有其他的CYP450基因参与大豆异黄酮的生物合成途径需要进一步挖掘。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提出了CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因在调控大豆异黄酮合成中的应用，揭示了CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26酶催化的分子机理。这些结果丰富了CYP450酶催化机制的多样性，以及反应了大豆异黄酮生物合成途径的多样性和复杂性。
[0005]根据本申请的一个方面，提供了CYP450基因在调控大豆异黄酮合成中的应用，该基因选自以下基因中的至少一种：CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因。
[0006]具体的，所述CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因为内质网定位。
[0007]具体的，所述CYP450基因的氨基酸序列包含K
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螺旋保守序列(KETLR)、LR列保守序列组成的E
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R
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R三联体(E
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R
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R triade)结构域和血红素结合结构域。
[0008]具体的，所述CYP93A1和CYP93A2基因编码的蛋白对3,9
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二羟紫檀碱具有催化活性，能催化3,9
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二羟紫檀碱生成大豆苷元。
[0009]在一些具体实施方案中，所述CYP93A2基因编码的蛋白对甘草素具有催化活性，能催化甘草素生成大豆苷元。
[0010]在一些具体实施方案中，所述CYP82D26基因编码的蛋白对柚皮素具有催化活性，能催化柚皮素生成大豆苷元。
[0011]根据本申请的另一个方面，还提供了CYP450基因在调控大豆苷元合成中的应用，该基因选自以下基因中的至少一种：CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因。
[0012]根据本申请的另一个方面，还提供了CYP450基因在培育转基因植物中的应用，该
基因选自以下基因中的至少一种：CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因。
[0013]在一些具体实施方案中，所述转基因植物产生大豆异黄酮。
[0014]在一些具体实施方案中，所述转基因植物选自大豆或其相近物种。
[0015]在一些具体实施方案中，所述CYP93A1和CYP93A2基因在大豆体内主要位于大豆苷元基因的下游。
[0016]在一些具体实施方案中，所述CYP82D26基因编码的蛋白的天然底物包含柚皮素和大豆苷元下游的化合物。
[0017]本专利技术的有益效果为：
[0018]1、本专利技术首次提出了CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因在合成大豆异黄酮中的应用，揭示了CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26酶催化的分子机理。
[0019]2、本专利技术首次发现了CYP93A1和CYP93A2能同时催化3,9
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二羟紫檀碱生成分别位于其代谢途径上游的大豆苷元和其下游的Glycinol。还首次发现了即能脱羟基，又兼具异黄酮合成酶功能的CYP82D26，其催化产物也是大豆苷元。
[0020]3、本专利技术体内结果表明，CYP82D26的天然底物可能不只是柚皮素这一种，也可能对大豆苷元下游的物质有催化活性。
[0021]4、本专利技术体内结果表明，CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因可以在植物体内合成大豆异黄酮。
附图说明
[0022]图1为大豆中CYP81、CYP82和CYP93蛋白的系统进化树；
[0023]图2为不同家族基因在不同组织的表达谱；
[0024]图3为CYP93家族的氨基酸序列的多重序列比对；
[0025]图4为以3,9
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二羟紫檀碱为底物饲喂在酵母中异源表达CYP93A1、CYP93A2和CYP93A3的酶活分析；(A)以空载体pYeDP60为阴性对照的酶活产物；(B
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D)分别是异源表达CYP93A1、CYP93A2和CYP93A3的酵母菌株的酶活产物；(E)3,9
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二羟紫檀碱标准品；(F)大豆苷元标准品；
[0026]图5为CYP93A1和CYP93A2催化3,9
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二羟紫檀碱的酶活产物峰P1和P2的紫外吸收图谱分析；(A)产物峰P1的紫外吸收图谱；(B)3,9
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二羟紫檀碱标准品的紫外吸收图谱；(C)产物峰P2的紫外吸收图谱；(D)大豆苷元的紫外吸收图谱；
[0027]图6为CYP93A1和CYP93A2催化3,9
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二羟紫檀碱的酶活产物P1和P2的UPLC/MS和UPLC/MS/MS鉴定；一级质谱图谱(左边)，二级质谱图谱(右边)。(A)3,9
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二羟紫檀碱的标准品；(B
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C)产物峰P1和P2；(D)大豆苷元的标准品；
[0028]图7为CYP93A1、CYP93A2和CYP93A3催化3,9
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二羟紫檀碱生成Glycinol和大豆苷元的转化率；
[0029]图8为以甘草素为底物饲喂在酵母中异源表达CYP93A1、CYP93A2和CYP93A3的酶活分析；(A)以空载体pYeDP60为阴性对照的酶活产物；(B
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D)分别是异源表达CYP93A1、CYP93A2和CYP93A3的酵母菌株的酶活产物；(E)甘草素标准品；(F)大豆苷元标准品；
[0030]图9为CYP93A1催化甘草素的酶活产物峰P的紫外吸收图谱分析结果；(A)产物峰P的紫外吸收图谱；(B)大豆苷元的紫外吸收图谱；
[0031]图10为CYP93A1催化甘草素的酶活产物峰P的UPL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CYP450基因在调控大豆异黄酮合成中的应用，其特征在于，该基因选自以下基因中的至少一种：CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CYP93A1、CYP93A2和CYP82D26基因为内质网定位。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CYP450基因的氨基酸序列包含K
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螺旋保守序列(KETLR)、LR列保守序列组成的E
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R
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R三联体(E
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R
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R triade)结构域和血红素结合结构域。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CYP93A1和CYP93A2基因编码的蛋白对3,9
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二羟紫檀碱具有催化活性，能催化3,9
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二羟紫檀碱生成大豆苷元。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞永珍，夏亚迎，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：