本发明专利技术公开了一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用，属于基因工程领域。本发明专利技术首次提出魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)yqjH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并提出将魏氏柠檬酸杆菌的yqjH基因敲除而获得基因敲除突变株ΔyqjH，并保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为：GDMCCNo：62255，菌体的生物被膜形成能力得到提高。本发明专利技术还提供了突变株的培养条件，使突变株形成生物被膜的能力比野生型菌株最高提高了4.20倍，可应用于生物被膜工程领域，从而拓宽了魏氏柠檬酸杆菌用于环境重金属离子污染治理和构建生物被膜蛋白合成工厂等的应用场景和范围。场景和范围。场景和范围。
【技术实现步骤摘要】
一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用
[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种魏氏柠檬酸杆菌yqjH基因敲除突变株及其应用。
技术介绍
[0002]柠檬酸杆菌属的细菌是革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，代谢方式有呼吸和发酵两种类型，是人及动物的正常肠道栖居菌群，柠檬酸杆菌在自然环境分布极广，如土壤、水、污水和食物中，本实验室从工业腐败产品中分离到的魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)，是柠檬酸杆菌属的细菌，贮藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 1.1242，该菌株兼性厌氧，具有一定的生物膜形成能力，但其形成的生物膜产量易受外界营养和环境条件的制约。
[0003]细菌生物被膜(BF)，是粘附于物品表面的细菌，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包裹而成的大量细菌聚集成庞大网络膜状物。细菌生物被膜是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象，由细菌及其分泌物积聚而成，其结构复杂，主要构成成分为：水、菌体、脂质、蛋白质、多糖、DNA、RNA等。激光共聚焦扫描显微镜技术观察BF独特的三维立体结构发现：细菌本身在生物被膜中仅占总体积的10％～20％，大部分是细菌分泌的粘性物质和胞外多糖。生物被膜的内部包含众多间隙和互通的通道，比表面积大，这赋予其强大的吸附能力和自我修复能力，细菌生物被膜这复杂特殊的结构，使得生物被膜内个体细菌比游离细菌的耐药性更强，被膜内的细菌不易被杀菌剂完全杀灭，一旦停用杀菌剂，耐药菌株迅速重新生成生物被膜，因此，除了细菌生物被膜具有一定的危害性以外，利用其比表面积，吸附力和生命力以及自我修复能力强的特点，可以对其进行开发利用，并已经成为在蛋白合成微工厂等领域应用的重要材料和载体。但上述应用必须以菌体能够形成足够多的生物被膜为基础，而如何提高生物被膜的形成量，一直是一个科研的难点和热点，另外，生物被膜的形成也受到外界营养和环境条件的影响和制约，寻找最佳的生物被膜形成条件，也应引起足够的重视。
[0004]yqjH基因与铁载体利用和铁调节相关，编码铁还原酶，可以催化铁螯合剂中三价铁还原为亚铁形式，从而铁载体释放铁到细胞质中，对维持铁在细胞中平衡有重要作用。该基因由yqhI控制转录。有报道称，枯草芽孢杆菌yqjH敲除后细菌对紫外照射敏感；鸭疫里默氏杆菌缺乏铁载体相互作用蛋白后其生物膜减少，毒力降低。目前没有魏氏柠檬酸杆菌中的yqjH基因的相关报道，其该基因在魏氏柠檬酸杆菌中可能具有重要的功能，可以使用基因工程等手段对其进行开发利用。
技术实现思路
[0005]本专利技术首次披露魏氏柠檬酸杆菌中的yqjH基因，并针对现有技术中魏氏柠檬酸杆菌在特定条件下生物被膜形成能力有限的不足，提供一种提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法，具体是采取基因工程手段，对细菌如魏氏柠檬杆菌中的部分基因如yqjH进行改
造和干预，研究发现可以提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜的形成量，从而提高其在环境治理和蛋白合成微工厂等方面的应用潜力。
[0006]本专利技术的第一个目的在于提供魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)中的yqjH基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因全长774bp，编码的蛋白有257个氨基酸序列。
[0007]本专利技术的第二个目的在于提供一种魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)yqjH基因敲除突变株，是将魏氏柠檬酸杆菌的yqjH基因敲除而获得，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选地，所述的突变株为魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)ΔyqjH，其保藏号为：GDMCC No：62255。
[0009]优选地，所述的突变株是以GDFMZ BF
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8为出发菌株，所述GDFMZ BF
‑
8的保藏号为GDMCC No:61858。
[0010]本专利技术的第三个目的在于提供上述yqjH基因和/或突变株在提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成中的应用。
[0011]优选地，所述突变株的产生物被膜条件是：于25℃～37℃，在LB、TSB或NB培养基中培养。
[0012]更优选地，所述突变株的产生物被膜条件为：
[0013]于25℃～37℃，在NB培养基中静置培养；
[0014]或于25℃～30℃，在LB培养基中静置培养，37℃振荡培养；
[0015]或于25℃～30℃，在TSB培养基中静置培养，37℃振荡培养。
[0016]最优选地，所述突变株的产生物被膜条件为：于30℃，在NB培养基中静置培养。
[0017]本专利技术的第四个目的是提供一种增加魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的方法，将魏氏柠檬酸杆菌野生菌株中的yqjH基因敲除，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0018]在一优选例中，所述方法包括以下步骤：
[0019](1)以提取的魏氏柠檬酸杆菌野生株基因组DNA作为模板，分别以yqjH
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up
‑
F和yqjH
‑
up
‑
R，yqjH
‑
down
‑
F和yqjH
‑
down
‑
R为引物，扩增得到yqjH基因的上下游同源序列；
[0020]所述的引物yqjH
‑
up
‑
F的序列如SEQ ID NO.4所示，
[0021]所述的引物yqjH
‑
up
‑
R的序列如SEQ ID NO.5所示，
[0022]所述的引物yqjH
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down
‑
F的序列如SEQ ID NO.6所示，
[0023]所述的引物yqjH
‑
down
‑
R的序列如SEQ ID NO.7所示；
[0024](2)用BglII单酶切pYG4质粒(其序列如SEQ ID NO.10所示)，并割胶回收；
[0025](3)扩增得到的yqjH基因的上下游同源片段，连接到酶切后的质粒pYG4上，构建敲除载体pYG4
‑
yqjH，然后热激转化大肠杆菌S17
‑
1；
[0026](4)将携带有敲除载体pYG4
‑
yqjH的大肠杆菌S17
‑
1与魏氏柠檬酸杆菌野生菌株共孵育，将共孵育物用敲除鉴定引物yqjH
‑
QJ
‑
F和yqjH
‑
QJ
‑
R鉴定yqjH基因一次交换重组子；
[0027]所述的引物yqjH
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QJ
‑
F的序列如SEQ ID NO.8所示，
[0028]所述的引物yqjH
‑
QJ
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)yqjH基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)yqjH基因敲除突变株，其特征在于，是将魏氏柠檬酸杆菌的yqjH基因敲除而获得，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求2所述的突变株，其特征在于，所述的突变株为魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)ΔyqjH，其保藏号为：GDMCC No：62255。4.根据权利要求2或3所述的突变株，其特征在于，所述的突变株是以GDFMZ BF
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8为出发菌株，所述GDFMZ BF
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8的保藏号为GDMCC No:61858。5.权利要求1所述的yqjH基因和/或权利要求2
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4任一项所述的突变株在提高魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，是在提高魏氏柠檬酸杆菌在聚苯烯附着材料形成生物被膜中的应用。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述突变株的产生物被膜条件是：于25℃～37℃，在LB、TSB或NB培养基中培养。8.一种增加魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的方法，其特征在于，将魏氏柠檬酸杆菌野生菌株中的yqjH基因敲除，所述的yqjH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以提取的魏氏柠檬酸杆菌野生株基因组DNA作为模板，分别以yqjH
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up
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F和yqjH
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R，yqjH
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F和yqjH
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down
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R为引物，扩增得到yqjH基因的上下游同源序列；所述的魏氏柠檬酸杆菌野生株为GDFMZ BF
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8，其保...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭红，周刚，王颖思，施庆珊，谢小保，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：
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