【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工领域，具体涉及l-苏氨酸合成关键酶的突变体。
技术介绍
1、l-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，是人和动物必需的、自身不能合成的氨基酸。l-苏氨酸具有平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等功能，因此被广泛应用于饲料、医药及食品工业中。目前，l-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，因而成为目前工业生产l-苏氨酸应用最广泛的方法。
2、大肠杆菌(escherichia coli)已经被广泛应用于工业发酵生产各类氨基酸。因此，运用代谢工程手段构建重组大肠杆菌是生产l-苏氨酸的有效途径。生物传感器已广泛应用于多种氨基酸高产菌株的途径优化和高效筛选。生物传感器是基于转录调控因子、rna开关等生物识别元件和荧光信号、酶活力等信号输出元件构建的一类生物传感器装置，能够感应细胞内特定代谢物浓度的变化，转化为可识别信号输出，在构建高效微生物细胞工厂中具有巨大应用潜力。通过后续偶联高通量筛选装置建立相应的小分子代谢物筛选技术，可以为快速筛选获得性能优异的菌种资源提供重要保障。由于缺乏简便快捷的检测方法，极大地限制了l-苏氨酸高产菌株的高通量筛选和选育。
技术实现思路
1、针对目前缺乏快速、灵敏且高特异性检测l-苏氨酸的方法的问题，前期(专利申请号：202311487621.2)构建了l-苏氨酸生物传感器。本专利技术基于这种l-苏氨酸生物传感器进行l-苏
2、一种l-苏氨酸合成关键酶突变体，所述突变体是对大肠杆菌宿主菌进行以下至少一种改进：
3、1)将大肠杆菌glta基因和pykf基因rbs位点进行优化；
4、2)将大肠杆菌苏氨酸合成途径关键酶thra进行饱和突变。
5、步骤1)具体为：将glta基因rbs位点由aaggag优化为cagggg，或保持不变；将pykf基因rbs位点由aagact优化为ttttca，ctcatg，gcgtag，tctcgg，catcat或gatggt。
6、优选的，所述突变体包括glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为ttttca的菌株，glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为ctcatg的菌株，glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为gcgtag的菌株，glta基因rbs位点为cagggg且pykf基因rbs位点为tctcgg的菌株，glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为catcat的菌株，glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为gatggt的菌株。
7、步骤2)具体为：将酶thra氨基酸序列353位点的氨基酸由s突变为f，e，r，l或v，或保持不变；将酶thra氨基酸序列354位点的氨基酸由s突变为w，y，v，f或l。
8、优选的，所述突变体包括酶thra氨基酸序列353位点的氨基酸由s突变为f且354位点的氨基酸由s突变为w的菌株，353位点的氨基酸由s突变为e且354位点的氨基酸由s突变为y的菌株，353位点的氨基酸由s突变为r且354位点的氨基酸由s突变为v的菌株，353位点的氨基酸由s突变为l且354位点的氨基酸由s突变为f的菌株，353位点的氨基酸由s突变为v且354位点的氨基酸由s突变为l的菌株，353位点的氨基酸为s且354位点的氨基酸由s突变为w的菌株。
9、另一方面，本专利技术还提供一种l-苏氨酸合成关键酶突变体的筛选方法，包括以下步骤：
10、(1)分别构建glta基因和pykf基因rbs文库、酶thra饱和突变文库；
11、(2)将文库质粒导入含有苏氨酸生物传感器的菌株；
12、(3)平板筛选绿色变得明亮的菌株，进行测序和发酵，获得l-苏氨酸合成关键酶突变体。
13、所述苏氨酸生物传感器包括转录调控因子laci编码基因、苏氨酸核糖开关thrl及其启动子、trc启动子、绿色荧光蛋白编码基因egfp和pet30a质粒骨架；所述转录调控因子laci编码基因、苏氨酸核糖开关thrl及其启动子来源于大肠杆菌；trc启动子和绿色荧光蛋白编码基因egfp序列为ncbi数据库标准序列。
14、所述菌株为大肠杆菌。
15、所述发酵的培养基配方为30g/l葡萄糖，25g/l(nh4)2so4，2g/l酵母提取物，2g/l柠檬酸，7.46g/l kh2po4，5mg/l mnso4·4h2o，5mg/l feso4·7h2o，2g/l mgso4·7h2o，20g/lcaco3，溶剂为水。
16、另一方面，本专利技术还提供l-苏氨酸合成关键酶突变体在生物合成l-苏氨酸中的应用。
17、本专利技术涉及的基因相关geneid如下：thra基因(geneid:945803)，glta基因(geneid:945323)，pykf基因(geneid:946179)。
18、本专利技术具有以下优点：
19、本专利技术利用前期(专利申请号：202311487621.2)构建的l-苏氨酸生物传感器，进行l-苏氨酸合成关键酶突变体的筛选，快速获得有益突变体，这些突变体能显著提升生物合成l-苏氨酸的产量。
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1.一种L-苏氨酸合成关键酶突变体，其特征在于，所述突变体是对大肠杆菌宿主菌进行以下至少一种改进：
2.根据权利要求1所述的L-苏氨酸合成关键酶突变体，其特征在于，步骤1)具体为：将gltA基因RBS位点由AAGGAG优化为CAGGGG，或保持不变；将pykF基因RBS位点由AAGACT优化为TTTTCA，CTCATG，GCGTAG，TCTCGG，CATCAT或GATGGT。
3.根据权利要求2所述的L-苏氨酸合成关键酶突变体，其特征在于，所述突变体包括gltA基因RBS位点为AAGGAG且pykF基因RBS位点为TTTTCA的菌株，gltA基因RBS位点为AAGGAG且pykF基因RBS位点为CTCATG的菌株，gltA基因RBS位点为AAGGAG且pykF基因RBS位点为GCGTAG的菌株，gltA基因RBS位点为CAGGGG且pykF基因RBS位点为TCTCGG的菌株，gltA基因RBS位点为AAGGAG且pykF基因RBS位点为CATCAT的菌株，gltA基因RBS位点为AAGGAG且pykF基因RBS位点为GATGGT的菌株。
4.根
5.根据权利要求4所述的L-苏氨酸合成关键酶突变体，其特征在于，所述突变体包括酶thrA氨基酸序列353位点的氨基酸由S突变为F且354位点的氨基酸由S突变为W的菌株，353位点的氨基酸由S突变为E且354位点的氨基酸由S突变为Y的菌株，353位点的氨基酸由S突变为R且354位点的氨基酸由S突变为V的菌株，353位点的氨基酸由S突变为L且354位点的氨基酸由S突变为F的菌株，353位点的氨基酸由S
6.一种权利要求1-5任一项所述的L-苏氨酸合成关键酶突变体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述苏氨酸生物传感器包括转录调控因子LacI编码基因、苏氨酸核糖开关thrL及其启动子、trc启动子、绿色荧光蛋白编码基因eGFP和pET30a质粒骨架；所述转录调控因子LacI编码基因、苏氨酸核糖开关thrL及其启动子来源于大肠杆菌；trc启动子和绿色荧光蛋白编码基因eGFP序列为NCBI
8.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。
9.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述发酵的培养基配方为30g/L葡萄糖，25g/L(NH4)2SO4，2g/L酵母提取物，2g/L柠檬酸，7.46g/L KH2PO4，5mg/L
10.权利要求1-5任一项所述的L-苏氨酸合成关键酶突变体在生物合成L-苏氨酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种l-苏氨酸合成关键酶突变体，其特征在于，所述突变体是对大肠杆菌宿主菌进行以下至少一种改进：
2.根据权利要求1所述的l-苏氨酸合成关键酶突变体，其特征在于，步骤1)具体为：将glta基因rbs位点由aaggag优化为cagggg，或保持不变；将pykf基因rbs位点由aagact优化为ttttca，ctcatg，gcgtag，tctcgg，catcat或gatggt。
3.根据权利要求2所述的l-苏氨酸合成关键酶突变体，其特征在于，所述突变体包括glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为ttttca的菌株，glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为ctcatg的菌株，glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为gcgtag的菌株，glta基因rbs位点为cagggg且pykf基因rbs位点为tctcgg的菌株，glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为catcat的菌株，glta基因rbs位点为aaggag且pykf基因rbs位点为gatggt的菌株。
4.根据权利要求1所述的l-苏氨酸合成关键酶突变体，其特征在于，步骤2)具体为：将酶thra氨基酸序列353位点的氨基酸由s突变为f，e，r，l或v，或保持不变；将酶thra氨基酸序列354位点的氨基酸由s突变为w，y，v，f或l。
5.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱红惠，苏卜利，邓名荣，李燕旋，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：
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