【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物以及医药，具体涉及检测枯草芽胞杆菌的特异性新分子靶标及其快速检测方法。
技术介绍
1、枯草芽胞杆菌，拉丁学名为bacillus subtilis，革兰氏染色为阳性，细胞无荚膜结构，周生鞭毛，能够运动，好氧或兼性厌氧生长。枯草芽胞杆菌在稳定生长后期，通常会产生圆形或椭圆形的芽胞休眠体。生长于固体培养基的枯草芽胞杆菌，其菌落通常呈白色至淡黄色，圆形或不规则形状，表面有皱褶，不透明；生长于液体培养基时，其表面常形成暗色，带有皱醭的菌膜。枯草芽胞杆菌能够分泌淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等，可以利用淀粉、脂类和蛋白质；能够产生果胶酶和糖化酶，分解植物组织的果胶和多糖；枯草芽胞杆菌也能够分泌多种生长激素和代谢产物，促进动植物健康生长；能够溶解磷钾，促进作物磷钾吸收。因此，枯草芽胞杆菌广泛应用于微生物肥料和微生物饲料。
2、枯草芽胞杆菌作为微生物肥料和饲料的核心菌种，其相对含量是发挥其重要功能的关键因素。因此，对枯草芽胞杆菌进行准确鉴定是其产品检测和质量评价的重要依据。近些年，随着微生物分类学和基因组学快速发展，许多与枯草芽胞杆菌近缘的物种被分离和鉴定。使用生理生化、菌落形态、脂肪酸测定等表型特征对枯草芽胞杆菌进行鉴定的操作繁琐，成本高，周期长，更关键的是这些传统表型特征很难实现枯草芽胞杆菌及其近缘物种的快速、精准区分。利用特异pcr技术是目前快速精准鉴定微生物的重要方法。在枯草芽胞杆菌鉴定方面，已建立了基于基因gyrb、rpob、gyra、β-半乳糖苷酶编码基因等的区分方法。但是，这些基因缺少物种划分阈值，而且由于
3、2005年，tettelin等在研究无乳链球菌不同致病菌株时首次提出泛基因组(pan-genome)概念。泛基因组是指一个物种内所有基因组信息的总和，包括核心基因和附属基因，而附属基因包括非必需基因和特异基因。其中，该物种所有样本共有的基因称为核心基因，仅在部分样本存在的基因称为非必需基因，某一样本特有的基因称为特异基因。因此，基于枯草芽胞杆菌及其近缘物种的泛基因组分析，能够获得枯草芽胞杆菌附属基因的特异基因，即这些基因仅仅存在于枯草芽胞杆菌，而在枯草芽胞杆菌近缘物种是不存在。利用这些特异基因，设计针对枯草芽胞杆菌的特异性检测引物，建立枯草芽胞杆菌快速、精准的检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供用于鉴定及检测枯草芽胞杆菌的特异性新分子靶标及其快速、精准的检测方法。
2、本专利技术根据原核微生物泛基因组分析软件(roary)获得枯草芽胞杆菌的特异基因集合。考虑到每个特异基因的序列长度、相似性、分辨力的差异，对每个基因进行评估，选择最优的特异基因，作为枯草芽胞杆菌检测的特异性分子靶标，包括核苷酸序列seq idno.1，用于识别检测菌株是否是枯草芽胞杆菌，检测样品中是否含有枯草芽胞杆菌。
3、本专利技术提供了一个用于检测枯草芽胞杆菌的特异性分子靶标，所述的枯草芽胞杆菌特异性分子靶标核苷酸序列如seq id no.1所示。
4、本专利技术提供了一组用于检测枯草芽胞杆菌的特异性引物，所述的特异性检测枯草芽胞杆菌的引物核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
5、本专利技术提供了一种快速、精准检测枯草芽胞杆菌的方法，提取样品基因组dna，使用上述用于检测枯草芽胞杆菌的引物进行pcr扩增，如扩增产物的条带大小为183bp，则待检测菌株为枯草芽胞杆菌，待检测样品含有枯草芽胞杆菌。
6、优选地，所述的pcr反应体系为：phantamax super-fidelity dnapolymerase 0.5μl，2×phanta max buffer 12.5μl，dntp mix(10mm)0.5μl，，上游引物(10μm)0.5μl，下游引物(10μm)0.5μl，模板dna(20ng/μl)0.5μl，补加ddh2o至总体积为25μl。
7、优选地，所述的pcr反应程序为：预变性，94℃，5min；变性，94℃，5min；退火，61℃30s；延伸，72℃12s；变性-退火-延伸，循环30次；再延伸，72℃10min；终止，16℃10min。
8、本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
9、本专利技术采用泛基因组学分析方法获得检测枯草芽胞杆菌的特异性分子靶标，建立了基于特异性分子靶标的枯草芽胞杆菌快速、精准pcr检测方法。与现有技术相比，本专利技术确定的枯草芽胞杆菌检测分子靶标的特异性高，分辨力强。同时，本专利技术基于特异性分子靶标建立的检测方法具有操作简单，特异性高，快速精准，费用低廉等优点。因此，本专利技术在微生物肥料、微生物饲料，微生物菌剂等相关产品的质检和质量评估等方面具有很好的应用前景。
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1.一个用于检测枯草芽胞杆菌的特异性分子靶标，其特征在于，所述的枯草芽胞杆菌特异性分子靶标核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一组用于检测枯草芽胞杆菌的特异性引物，其特征在于，所述的检测枯草芽胞杆菌特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
3.一种用于枯草芽胞杆菌的快速、精准检测方法，其特征在于，提取检测菌株或检测样品的基因组DNA，然后使用权利要求2所述的用于检测枯草芽胞杆菌的特异性引物进行PCR扩增，若扩增产物的条带大小为183bp，则表明检测菌株为枯草芽胞杆菌，检测样品含有枯草芽胞杆菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR，其反应体系为PhantaMaxSuper-Fidelity DNAPolymerase 0.5μL，2×Phanta Max Buffer 12.5μL，dNTP Mix(10mM)0.5μL，上游引物(10μM)0.5μL，下游引物(10μM)0.5μL，模板DNA(20ng/μL)0.5μL，补加ddH2O至总体积为25μL。
5.根据权利
...【技术特征摘要】
1.一个用于检测枯草芽胞杆菌的特异性分子靶标，其特征在于，所述的枯草芽胞杆菌特异性分子靶标核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一组用于检测枯草芽胞杆菌的特异性引物，其特征在于，所述的检测枯草芽胞杆菌特异性引物核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
3.一种用于枯草芽胞杆菌的快速、精准检测方法，其特征在于，提取检测菌株或检测样品的基因组dna，然后使用权利要求2所述的用于检测枯草芽胞杆菌的特异性引物进行pcr扩增，若扩增产物的条带大小为183bp，则表明检测菌株为枯草芽胞杆菌，检测样品含有枯草芽胞杆菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱红惠，刘阳，杜娟，段娇，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：
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