香蕉MtLUT5基因、克隆方法、表达载体及应用技术

本发明专利技术公开香蕉MtLUT5基因，提取“派露丝”香蕉总RNA，反转录合成cDNA，设计特异引物，利用PCR方法获得MtLUT5基因的全长cDNA，与

【技术实现步骤摘要】
香蕉MtLUT5基因、克隆方法、表达载体及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及香蕉LUT5基因的克隆、表达特性分析、表达载体构建、对类胡萝卜素的调控作用。

技术介绍

[0002]类胡萝卜素是保障人体营养和健康最必需的成分之一，人类自身无法合成，因此只能依赖于自然资源或者膳食补充剂。维生素A缺乏症(VAD)是世界范围内严重的公共卫生问题，在发展中国家最为严重。发展中国家80％以上的维生素A来源于植物维生素A原类胡萝卜素(pVACs)。香蕉是世界范围内一些最贫穷地区(包括非洲和亚洲)的淀粉类主食，在解决发展中国家VAD方面变得越来越重要。香蕉果肉含有多种类胡萝卜素，其中主要积累的α
‑
胡萝卜素和β
‑
胡萝卜素是维生素A的前体，可以降低人类传染病、精神障碍、视力丧失等残疾的发病率和死亡率；叶黄素虽没有维生素A活性，却是具有能强力清除单态氧的抗氧化剂，能帮助清除自由基，减缓骨质疏松。
[0003]目前，许多商业主栽品种，尤其是一些“卡文迪许”组的品种，pVAC含量较低，因此选择“卡文迪许”组的“派露丝”香蕉(CN20120829.1A)展开研究，以期获得高类胡萝卜素香蕉。人类食用的香蕉多为三倍体、单性结实，且生命周期较长，通过传统育种在香蕉中引入新性状仍非常困难，最合适的策略是对已接受的品种进行基因改造。LUT5调控植物高效生产叶黄素，同时限制α
‑
胡萝卜素的积累，且在弱光条件需要二者时，通过调节CYP97A3酶生成叶黄素和α
‑
胡萝卜素。另外，LUT5对β
‑
胡萝卜素的β
‑
环具有一定活性。但LUT5如何调控类胡萝卜素含量和组成尚未可知。目前，也还没有关于香蕉LUT5基因作用及其功能的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种香蕉MtLUT5基因香蕉MtLUT5基因，该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本专利技术从“派露丝”叶片中分离出LUT5基因的全长cDNA，并首次鉴定出MtLUT5具有促进类胡萝卜素形成的功能。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供一种香蕉MtLUT5基因的克隆方法，包括以下步骤：
[0006](1)以“派露丝”香蕉(AAA,Musa spp.)叶片为材料，利用CTAB法提取总RNA：
[0007](2)MtLUT5基因的克隆：
[0008](2
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1)利用TransScript公司的One
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；
[0009](2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物；
[0010](2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接Trans公司的克隆载体进行蓝白斑筛选和PCR检测后进行序列测定。
[0011]进一步地，步骤(1)总RNA的提取具体如下：
[0012](1
‑
1)在2mL无酶离心管中加入850μL 1x CTAB，65℃水浴锅中预热；
[0013](1
‑
2)液氮倒入无酶处理过的研钵进行预冷，派露丝香蕉叶片在液氮中充分研磨，
研磨好的粉末加入CTAB前，加入20μLβ
‑
巯基乙醇；
[0014](1
‑
3)剧烈振荡，涡旋30s，65℃水浴加热6min；
[0015](1
‑
4)往离心管中加入850μL、体积比24:1的氯仿：异戊醇，摇匀涡旋30s后，4℃，11000rpm离心15min，管内分成三层；
[0016](1
‑
5)小心吸取上层清液进2mL无酶离心管，再次加入850μL、体积比24:1的氯仿：异戊醇，重复上述操作；
[0017](1
‑
6)吸取上层清液进1.5mL无酶离心管，加入350μL 8M LiCl，4℃沉淀5h；
[0018](1
‑
7)沉淀完成后，4℃，11000rpm高速离心30min，弃上清；
[0019](1
‑
8)加入500μL 70％乙醇清洗两次沉淀后打开盖子，室温放置3
‑
5min晾干沉淀；
[0020](1
‑
9)吸取20
‑
30μL DEPC水加入离心管，充分溶解沉淀RNA；
[0021](1
‑
10)吸取少量RNA进行检测，确定是否符合要求用于后续实验，RNA纯度和浓度检测数据由分光光度计分析得到；完整性检测结果由1％琼脂糖凝胶电泳检测得出；
[0022](1
‑
11)剩余RNA做好标记后，
‑
80℃保存备用。
[0023]进一步地，步骤(2
‑
2)中的扩增引物包括MtLUT5 F引物和MtLUT5 R引物，序列分别如序列表中的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，具体如下表1所示。
[0024]表1 LUT5基因cDNA全长克隆引物
[0025][0026]PCR体系及条件为：
[0027][0028][0029]分离出的开放阅读框部分为1971bp，编码656个氨基酸。将氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与已发表的玉米LUT5蛋白的氨基酸同源性为85％，与预测的生姜、油棕、海枣、芦笋蛋白序列同源性则高达98％、96％、93％、92％。
[0030]本专利技术的再一目的在于提供一种香蕉MtLUT5基因表达载体，利用了所述的香蕉MtLUT5基因为目的基因的表达载体，具体是香蕉MtLUT5基因插入到植物表达载体pBI121上，构建pBI121
‑
MtLUT5超表达重组载体。
[0031]进一步地，根据已测序的MtLUT5基因序列，设计在5
’
端加上KpnI酶切位点的上游引物P1和在3
’
端加上XbaI酶切位点的下游引物P2，通过PCR反应，将KpnI和XbaI酶切位点分别加在目的片段的5
’
端和3
’
端，回收PCR产物，用KpnI和XbaI双酶切植物表达载体pBI121，并将获得的含有两个酶切位点的基因和pBI121载体大片段连接获得含有MtLUT5基因的表达载体。
[0032]进一步地，所述上游引物P1和下游引物P2的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；
[0033]具体为上游引物P1：
[0034]5’‑
CGGGGGACGAGCTCGGTACCTCGTGGGGGAGCAAGAGTAAC
‑3’
；
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种香蕉MtLUT5基因，其特征在于：该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种香蕉MtLUT5基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以“派露丝”香蕉叶片为材料，利用CTAB法提取总RNA：(2)MtLUT5基因的克隆：(2
‑
1)利用TransScript公司的One
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；(2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物；(2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接Trans公司的
‑
Blunt克隆载体进行蓝白斑筛选和PCR检测后进行序列测定。3.根据权利要求2所述的香蕉MtLUT5基因的克隆方法，其特征在于，步骤(1)总RNA的提取具体如下：(1
‑
1)在2mL无酶离心管中加入850μL 1x CTAB，65℃水浴锅中预热；(1
‑
2)液氮倒入无酶处理过的研钵进行预冷，派露丝香蕉叶片在液氮中充分研磨，研磨好的粉末加入CTAB前，加入20μLβ
‑
巯基乙醇；(1
‑
3)剧烈振荡，涡旋30s，65℃水浴加热6min；(1
‑
4)往离心管中加入850μL、体积比24:1的氯仿：异戊醇，摇匀涡旋30s后，4℃，11000rpm离心15min，管内分成三层；(1
‑
5)小心吸取上层清液进2mL无酶离心管，再次加入850μL、体积比24:1的氯仿：异戊醇，重复上述操作；(1
‑
6)吸取上层清液进1.5mL无酶离心管，加入350μL 8M LiCl，4℃沉淀5h；(1
‑
7)沉淀完成后，4℃，11000rpm高速离心30min，弃上清；(1
‑
8)加入500μL 70％乙醇清洗两次沉淀后打开...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐立，李志英，王加宾，陈莹，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，
类型：发明
国别省市：