藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1及其制备方法和应用，所述CqMSRA5.1基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因在培育抗逆作物中有潜在的应用价值。用价值。

【技术实现步骤摘要】
藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物基因工程
，特别是，涉及一种藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]干旱和高盐等逆境是限制植物产量的重要因素。因此，鉴定抗逆相关基因用于作物改良是未来抗逆育种的关键策略之一。MSR（甲硫氨酸亚砜还原酶）能被非生物胁迫诱导表达，而且MSR可以清除机体内过量的ROS，在保护植物的生长和产量中发挥重要作用。藜麦作为典型的杂粮作物之一，喜高海拔、耐寒、耐盐碱和贫瘠，是否可研究其内MSR及应用，是本领域值得关注的技术问题。

技术实现思路

[0003]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1及其制备方法和应用，该基因在培育抗逆作物中有潜在的应用价值。
[0004]为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1，所述CqMSRA5.1基因的cDNA的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
[0005]本专利技术还包括上述藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1的制备方法，包括步骤：S101.提取藜麦稼祺505总RNA并以总RNA反转录获得总cDNA；S102.以CqMSRA5.1
‑
F、CqMSRA5.1
‑
R为引物，以反转录获得的总cDNA为模板进行PCR扩增，得到目标片段；其中，CqMSRA5.1
‑
F序列如SEQIDNo.2所示、CqMSRA5.1
‑
R序列如SEQIDNo.3所示；S103.PCR产物经凝胶回收、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1。
[0006]进一步的，所述步骤S103中，所述PCR的扩增体系为：cDNA110
×
Buffer2dNTP(2.5mMeach)0.4CqMSRA5.1
‑
F引物F(10
µ
M)0.5CqMSRA5.1
‑
R引物R(10
µ
M)0.5TransTaqHiFiDNA聚合酶0.2补充双蒸水至20。进一步的，所述步骤S103中，扩增条件为：95℃5min
94℃30s55℃30s72℃1.5min2
‑
4步骤循环35次72℃10min10℃保存。本专利技术还包括上述藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1在植株中表达以提高植株抗盐和耐旱性的应用。
[0007]优选的，所述植株为拟南芥。
[0008]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：利用基因工程技术，本专利技术首次克隆得到了藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1并进行了功能验证，通过不同诱导子处理显示该基因与抗盐和抗旱密切相关；对于该基因CqMSRA5.1的研究具有重要理论意义和应用前景。
附图说明
[0009]图1为CqMSRA5.1基因的cDNA电泳图，其中：Marker为DNA Marker，泳道2为CqMSRA5.1的cDNA；图2为甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1在转基因拟南芥中RealTime
‑
PCR表达分析，其中，Clo
‑
0为野生型，AtOE1和AtOE 2为CqMSRA5.1基因在拟南芥中的过表达系，msrb5是MSRA5基因缺失系；图3为转基因的拟南芥中NaCl处理分析，其中WT为野生型，AtOE1和AtOE 2为RealTime
‑
PCR分析的过表达系，msrb5是MSRA5基因缺失系；图4为转基因的拟南芥中控水试验的分析，其中WT为野生型，AtOE1和AtOE 2为RealTime
‑
PCR分析的过表达系，msrb5是MSRA5基因缺失系。
具体实施方式
[0010]下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。
[0011]实施例1、CqMSRA5.1的克隆1.1提取藜麦稼祺505总RNA1)将稼祺505植物材料放入研钵中，加入液氮将其研磨成粉；2)待液氮挥发后，取约100
‑
200mg粉末转入到1.5ml离心管中，加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温静置5 min；3)4℃，12000rpm，离心10min后，取0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2 ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温静置2
‑
5min；4)4℃，12000rpm，离心10min后，取0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，加入0.4ml异丙醇后混匀，室温静置15mim；5)4℃，12000rpm，离心10min，弃上清，用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀两次后，于4℃，8000rpm，离心5 min；6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2
‑
5min，加入40
µ
l RNase
‑
Free水，在
60℃中充分溶解RNA 10min；7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A
260
/A
280
达到1.7
‑
2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。
[0012]总cDNA的合成1) 向离心管中依次加入下列物质（40
µ
l 反应体系）：总RNA3
µ
goligo
‑
dT(0.05
µ
g/
µ
l)2dNTP(0.01
µ
g/
µ
l)2RNase
‑
Free水至272) 轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；3) 向离心管中依次加入下列物质5
×
buffer820mMDTT4MMLV14) 轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，
‑
20℃保存备用。
[0013]反应以CqMSRA5.1
‑
F、CqMSRA5.1
‑
R为引物，以反转录获得的总cDNA为模板进行PCR扩增，得到目标片段；引物序列如下：CqMSRA5.1
‑
F：
ꢀ‑5’ꢀ
ATGAATCGGAAGGCAAAAATAAGAA3
’‑
CqMSRA5.1
‑
R：
ꢀ‑5’ꢀ
TTATATTTCCCTCAAAACAGGCCAG3
’‑
Trans HiFi Taq高保真酶扩增的反应体系如下（50
µ
l体系）：总cDNA110
×
Buffer2dNTP(2.5mMeach)0.4CqMSRA5.1
‑
F引物F(10
µ
M)0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1，其特征在于，所述CqMSRA5.1基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.权利要求1所述藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1的制备方法，包括步骤：S101. 提取藜麦稼祺505总RNA并以总RNA反转录获得总cDNA；S102. 以CqMSRA5.1
‑
F、CqMSRA5.1
‑
R为引物，以反转录获得的总cDNA为模板进行PCR扩增，得到目标片段；其中，CqMSRA5.1
‑
F序列如SEQ ID No.2所示、CqMSRA5.1
‑
R序列如SEQ ID No.3所示；S103. PCR产物经凝胶回收、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到藜麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因CqMSRA5.1。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S103中，所述PCR的扩增体系为：总cDNA1
µ
l10

【专利技术属性】
技术研发人员：丁鹏程，李小芬，崔开源，任爱霞，林文，武祥云，孙敏，高志强，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：