一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法及应用。本发明专利技术利用根癌农杆菌介导遗传转化技术将过表达葡萄糖

【技术实现步骤摘要】
一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种利用辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高其虫草素产量的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]蛹虫草(Cordyceps militaris)是我国一种传统的药食两用真菌，为子囊菌纲肉座目麦角菌科虫草属，具有很高的药用价值和营养价值。研究表明，蛹虫草化学成分包括虫草素、腺苷、多糖、脂肪酸、氨基酸、麦角甾醇等多种活性成分，虫草素(Cordycepin)是其主要活性成分之一，也是评价蛹虫草质量的重要指标。虫草素的药理活性包括抗肿瘤、抗突变、抗真菌、免疫调节等方面，美国已将虫草素作为抗癌抗白血病的新药进入临床试用。传统的虫草素是从天然蛹虫草中提取(但含量较低)，并且天然蛹虫草生长缓慢以及过度开发，无法满足市场需求，造成虫草素价格飞涨，目前售价已超过500000美元/kg。虫草素可以通过化学合成法和生物法获得。化学合成法原料成本高，工艺繁琐，收率低且副产物多，限制其工业应用；生物法合成虫草素主要采用液体发酵的方式，液体发酵较其他方法存在发酵过程容易控制，周期短等优势。目前提高虫草素产量的措施主要在菌种改良、过程工艺优化等方面积累了大量的工作，例如诱变育种、提高碳源利用效率、提高前体供应等。
[0003]辅因子代谢工程策略是通过调控细胞内关键酶的辅因子(NADPH/NADP
+
、NADH/NAD
+
、ATP/ADP等)种类和比例，增加目标产物代谢通路流量，提高目标代谢物产量的一种策略，已成功应用于酿酒酵母、黑曲霉等多种微生物。辅因子作为生物体内的基本调控子，涉及到多种生物过程(如能量代谢、抗氧化还原压力、细胞衰老/死亡等)，并且多种辅因子协同参与调控同一生物反应。NADP
+
/NADPH是生物体内重要的辅因子之一，NADPH作为还原力，影响氨基酸、脂质和核苷酸的合成反应。因此，充足的NADPH供应对维持胞内氧化还原平衡和氨基酸生物合成十分必要。
[0004]磷酸戊糖途径对于维持胞内NADPH的产生至关重要，调节磷酸戊糖途径通量是辅因子代谢工程的重要策略，通过提高葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶(G6PDH)、6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)等参与NADPH合成的关键酶的酶活调节胞内NADPH/NADP
+
平衡，进而调控产物合成。G6PDH是磷酸戊糖途径第一步反应的关键调节酶，催化葡萄糖
‑6‑
磷酸转化为6
‑
磷酸葡糖酸内酯和NADPH；6PGD催化磷酸戊糖途径第三步反应，催化6
‑
磷酸葡萄糖酸反应生成核酮糖
‑5‑
磷酸和NADPH。基于辅因子代谢工程策略，通过过表达G6PDH或6PGD的编码基因强化胞内NADPH供应，提高蛹虫草菌内虫草素产量具有可行性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是基于辅因子代谢工程策略运用基因工程技术通过过表达参与NADPH合成的关键酶编码基因改造蛹虫草菌，强化胞内NADPH供应，获得高产虫草素的蛹虫草重组菌株。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术首要目的是请求保护过表达参与NADPH合成的关键酶编码基因在提高虫草素产量中的应用，NADPH合成关键酶(G6PDH或6PGD)编码基因gsdA具有如SEQ ID NO.3所示序列，基因gndA具有如SEQ IDNO.4所示序列。
[0008]本专利技术提供了一种基于辅因子代谢工程策略提高虫草素产量的方法，所述提高虫草素产量的方法是通过基因工程手段构建目的基因过表达的蛹虫草突变菌株；所述目的基因为葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶(G6PDH)编码基因gsdA或葡萄糖酸
‑6‑
磷酸脱氢酶(6PGD)编码基因gndA。
[0009]具体地，所述过表达gsdA或gndA基因的蛹虫草重组菌株按下述方法构建：
[0010](1)提取蛹虫草C.militaris的mRNA，逆转录制备cDNA，以cDNA为模板克隆gsdA或gndA基因；
[0011](2)将线性化载体与目的基因gsdA或gndA连接后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR扩增、酶切和测序验证后筛选获得基因过表达质粒pDHt
‑
SK
‑
BenA
‑
gsdA/gndA的大肠杆菌；
[0012](3)将上述质粒转入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciensAGL1，通过YEB固体筛选培养基(含50
‑
100μg/mL羧苄青霉素和50
‑
100μg/mL卡那霉素)培养，经PCR验证及酶切验证后筛选获得含质粒pDHt
‑
SK
‑
BenA
‑
gsdA/gndA的根癌农杆菌；
[0013](4)根癌农杆菌(含有质粒pDHt
‑
SK
‑
BenA
‑
gsdA/gndA)经IM液体培养基诱导培养后，与野生型蛹虫草C.militaris孢子悬液共培养，使用M
‑
100固体培养基(含头孢噻肟和苯菌灵)抗性筛选，获得蛹虫草重组菌株；
[0014](5)将上述筛选获得的蛹虫草重组菌株提取基因组，PCR验证正确后，进行摇瓶液体发酵，经HPLC检测发酵液中虫草素产量，筛选获得虫草素产量提高的蛹虫草重组菌株；
[0015](6)经多次传代培养并经过液体发酵验证，最终获得高产虫草素且稳定遗传的蛹虫草重组菌株。
[0016]进一步，步骤(1)中所述葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶基因的基因符号为gsdA，Genebank核苷酸序列号CCM_06983；葡萄糖酸
‑6‑
磷酸脱氢酶基因的基因符号为gndA，Genebank核苷酸序列号CCM_06873。所述目的基因gsdA(或gndA)利用PCR技术从蛹虫草菌cDNA扩增所得，所述蛹虫草菌为C.militaris CGMCC3.14242，所述gsdA/gndA基因PCR扩增引物对分别为：
[0017]gsdA
‑
F：5
’‑
ATGATGCACAAGACCATTAAGAACA
‑3’
；
[0018]gsdA
‑
R：5
’‑
TTACAGCTTGTTGCTAGAGTTGTTGT
‑3’
；
[0019]gndA
‑
F：5
’‑
ATGTCTGGTCCTGTTGCTCGA
‑3’
；
[0020]gndA
‑
R：5
’‑
TTAAGCCTGGTAGGTAGAGGCAG
‑3’
。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于辅因子代谢工程策略提高蛹虫草菌虫草素产量的基因改造，其特征在于，过表达葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶编码基因gsdA或6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gndA，强化NADPH的供应以提高虫草素产量，基因gsdA及gndA来源于蛹虫草菌，基因gsdA具有如SEQ ID NO.3所示序列，基因gndA具有如SEQ IDNO.4所示序列。2.一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法，其特征在于：通过基因工程的手段将目的基因gsdA或gndA导入蛹虫草菌中构建基因过表达的蛹虫草重组菌株。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，运用根癌农杆菌介导转化技术将过表达葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶编码基因gsdA或6
‑
磷酸葡萄糖酸脱氢酶编码基因gndA的重组质粒导入蛹虫草中，构建蛹虫草重组菌株。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，蛹虫草重组菌株构建方法如下：S1.提取蛹虫草Cordyceps militaris的mRNA，逆转录制备cDNA，以cDNA为模板克隆gsdA或gndA基因；S2.将目的基因gsdA或gndA与线性化载体pDHt
‑
SK
‑
BenA连接后，转入大肠杆菌感受态细胞中，经PCR扩增、酶切、基因测序等验证筛选转化子，获得含重组载体pDHt
‑
SK
‑
BenA
‑
gsdA/gndA的大肠杆菌；S3.液体培养S2得到的含重组载体的大肠杆菌，提取质粒，将所述重组载体转入根癌农杆菌AGL
‑
1感受态细胞中，利用含50
‑
100μg/mL羧苄青霉素及50
‑
100μg/mL卡那霉素的YEB固体培养基进行培养并筛选转化子，经PCR扩增、酶切等验证后，获得含重组载体pDHt
‑
SK
‑
BenA
‑
gsdA/gndA的根癌农杆菌；S4.将步骤S3得到的含重组载体pDHt
‑
SK
‑
BenA
‑
gsdA/gndA的根癌农杆菌在IM液体培养基中诱导培养后，与蛹虫草菌孢子悬液在IM固体培养基上共培养，同时覆盖含头孢噻肟和苯菌灵的M
‑
100固体培养基，筛选蛹虫草转化子并进一步在含头孢噻肟和苯菌灵的M
‑
100固体培养基上进行二次筛选，经PCR扩增、基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亮，康亚然，李倩，黄翠婷，程婧妍，刘冰南，李成，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：