本发明专利技术公开香蕉SSUII基因,通过提取香蕉“Musa spp.”总RNA,反转录合成cDNA,设计特异引物,利用PCR方法获得SSU
Banana ssuii gene, cloning method, expression vector and Application
【技术实现步骤摘要】
香蕉SSUII基因、克隆方法、表达载体及应用
[0001]本专利技术属于生物
,涉及香蕉SSUII基因的克隆、表达特性分析、表达载体构建、对香蕉类胡萝卜素合成的调控作用。
技术介绍
[0002]类胡萝卜素普遍存在于所有高等植物中,因其为维生素A的前体及能够强力清除单态氧的抗氧化剂而成为人体营养和健康最必需的成分之一,被称为维生素A原。医学研究证明,类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面起着重要的作用。当人体类胡萝卜素摄取量不达标时,则会引发相应的疾病,例如维生素A缺乏症(Vitamin A deficiency,VAD)与微量营养元素缺乏(Micronutrient deficiencies,MNDs)。世界卫生组织(WHO)估计,有25万至50万儿童因缺乏维生素A而失明,撒哈拉以南非洲和南亚是VAD的高发区。微量营养元素缺乏会造成“隐形饥饿”,导致传染病、精神障碍和视力丧失等残疾的发病率上升,甚至死亡。
[0003]香蕉(Musa spp.),芭蕉科芭蕉属多年生大型常绿单子叶草本植物,是世界四大水果之一,也是许多发展中国家的主要粮食作物,具有很高的经济价值及营养价值,但常见香蕉品种中类胡萝卜素含量相对匮乏。不同香蕉品种类胡萝卜素含量存在差异,密克罗尼西亚联邦的研究发现,黄色和橙色果肉的香蕉品种含有最高水平的反式β
‑
胡萝卜素。前期的研究发现,目前主要栽培的AAA 型香蕉中类胡萝卜素含量较低,但非主栽品种TTT型的Karat香蕉中,成熟香蕉的类胡萝卜素含量高达2230μg/100g,是香蕉主要栽培品种类胡萝卜素含量的100倍以上。
[0004]高等植物通常有一个短链prenyltransferase(PTS)基因家族,HeterodimericGeranylgeranyl Pyrophosphate Synthase Small Subunit(SSUII)基因属于此家族,是类胡萝卜素合成的前体基因,在类胡萝卜素合成途径中发挥作用的位置极为关键,通过影响下游类胡萝卜素合成相关基因的表达,调控类胡萝卜素合成及积累。
[0005]通过对比TTT型香蕉和AAA型香蕉的转录组发现,普通AAA型香蕉中只含有一个SSUII基因,而TTT型Karat香蕉SSUII基因有三个拷贝。同时实时荧光定量PCR结果表明,TTT型香蕉中的SSUII基因表达量明显高于AAA型及 BB型香蕉的表达量。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于提供一种香蕉SSUII基因香蕉SSUII基因,该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本专利技术从香蕉叶片中分离出SSUII 基因的全长cDNA,并首次鉴定出SSUII具有促进类胡萝卜素形成的功能。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一种香蕉SSUII基因的克隆方法,包括以下步骤:
[0008](1)以Karat香蕉(Musa spp.)为材料,利用CTAB法提取总RNA:
[0009](2)SSUII基因的克隆:
[0010](2
‑
1)利用Invitrogen公司的Superscript III Kit将RNA反转录为cDNA,作为PCR
模板备用;
[0011](2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物;
[0012](2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后,进行PCR扩增,并将获得的产物连接到大肠杆菌,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。
[0013]进一步地,步骤(1)总RNA的提取具体如下:
[0014](1
‑
1)取1mL CTAB提取液分装到2mL离心管中,65℃预热;
[0015](1
‑
2)称取0.2g材料,在液氮中研磨后立即转入含有CTAB提取液的离心管中,涡旋混合,65℃温浴2~3min;
[0016](1
‑
3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇24:1,涡旋混合,室温,10000rpm 离心15min;
[0017](1
‑
4)吸取上清到一新的离心管中,重复步骤(1
‑
3);
[0018](1
‑
5)取上清到一新的离心管中,加入1/3体积的8M LiCl,4℃沉淀过夜;
[0019](1
‑
6)4℃,10000rpm离心30min;
[0020](1
‑
7)弃上清,沉淀用70%乙醇洗涤,再用无水乙醇洗涤;
[0021](1
‑
8)将沉淀溶解在65℃预热的100μl STE中,立即用氯仿/异戊醇抽提一次;
[0022](1
‑
9)取上清,加入2倍体积的无水乙醇,
‑
80℃沉淀30min,或
‑
20℃沉淀 2h;
[0023](1
‑
10)4℃,10000rpm离心20min;
[0024](1
‑
11)沉淀分别用75%的乙醇和无水乙醇洗涤,干燥后用20ul RNase
‑
free 水溶解。
[0025]进一步地,步骤(2
‑
2)中的扩增引物包括5
’
端引物和3
’
端引物,序列分别如序列表中的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示,具体如下:
[0026]5’
端引物:5
’
CCCAATCGTCTTCTTTATCG 3
’
[0027]3’
端引物:5
’
ACTCAGCCATCAGTCAACCT 3
’
。
[0028]PCR体系及条件为:
[0029][0030][0031][0032]SSUII获得全长的cDNA为1309bp,均包括部分起始密码子前的5
’
UTR和终止密码子后的3
’
UTR。开放阅读框部分为1053bp,由此推得3组具有350个氨基酸的一段序列,通过对比发现,氨基酸序列具有一个富含天门冬氨酸的FARM结构域(DDXXXXD,“X”为任意氨基酸),以及两个CXXXC结构域(“X”为任意氨基酸)。将氨基酸序列在国际基因库中进行比较,表明与已发表的姜黄、稻米籼、铁皮石斛的SSUII蛋白的氨基酸同源性分别为77%、69%、66%。
[0033]本专利技术的再一目的在于提供一种香蕉SSUII基因表达载体,利用了所述的香蕉SSUII基因为目的基因的表达载体,具体是香蕉SSUII基因插入到植物表达载体pBI121上,构建成在35S启动子下游含有香蕉SSUII基因的高效表达载体。
[0034]进一步地,根据已测序的SSU
‑
II基因序列,设计在5
’
端加上KpnI本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种香蕉SSUII基因,其特征在于:该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种香蕉SSUII基因的克隆方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)以Karat香蕉叶片为材料,利用CTAB法提取总RNA:(2)SSUII基因的克隆:(2
‑
1)利用Invitrogen公司的Superscript III Kit将RNA反转录为cDNA,作为PCR模板备用;(2
‑
2)设计全长cDNA扩增引物;(2
‑
3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后,进行PCR扩增,并将获得的产物连接到大肠杆菌,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。3.根据权利要求2所述的香蕉SSUII基因的克隆方法,其特征在于,步骤(1)总RNA的提取具体如下:(1
‑
1)取1mL CTAB提取液分装到2mL离心管中,65℃预热;(1
‑
2)称取0.2g材料,在液氮中研磨后立即转入含有CTAB提取液的离心管中,涡旋混合,65℃温浴2~3min;(1
‑
3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇24:1,涡旋混合,室温,10000rpm离心15min;(1
‑
4)吸取上清到一新的离心管中,重复步骤(1
‑
3);(1
‑
5)取上清到一新的离心管中,加入1/3体积的8M LiCl,4℃沉淀过夜;(1
‑
6)4℃,10000rpm离心30min;(1
‑
7)弃上清,沉淀用70%乙醇洗涤,再用无水乙醇洗涤;(1
‑
8)将沉淀溶解在65℃预热的100μl STE中,立即用氯仿/异戊醇抽提一次;(1
‑
9)取上清,加入2倍体积的无水乙醇,
【专利技术属性】
技术研发人员:徐立,王加宾,李志英,王小冰,李春燕,
申请(专利权)人:中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,
类型:发明
国别省市:
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。