【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质理性设计和系统代谢工程改造，更具体的说是涉及ectyra蛋白突变体及其在提高l-苯丙氨酸产量中的应用。
技术介绍
1、随着基因编辑、蛋白质工程等生物技术的发展，以微生物为研究对象，以系统代谢工程改造及合成生物学方法为技术手段，构建高效的微生物细胞工厂，实现了绿色、清洁、可持续的芳香族化合物及其衍生物的生产。芳香族氨基酸是指分子结构式中含有苯环的氨基酸，包括l-苯丙氨酸(l-phe)、l-酪氨酸(l-tyr)和l-色氨酸(l-trp)，存在于绝大多数生命体中，也可从食物中获得。其中，l-苯丙氨酸作为人体必需氨基酸，是复配氨基酸输液的重要成分之一，还可作为药物(如多巴胺、肾上腺素、甲状腺素、利托那韦、对氟苯丙氨酸、甲酰溶肉瘤素、脑神经传递素等)中间体和抗癌药物的良好载体。当l-苯丙氨酸作为载体时，它可以把抗肿瘤药物载入肿瘤所在部位，既抑制肿瘤生长，又可以大大降低肿瘤药物的毒性。
2、芳香族氨基酸合成途径主要分为三大模块：中心碳代谢途径(ccm)、莽草酸(shik)途径和分支酸(cha)途径。l-苯丙氨酸合成途径是以葡萄糖为起点，经过中心代谢途径，相继生成磷酸烯醇式丙酮酸(pep)和赤藓糖-4-磷酸(e4p)，紧接着二者缩合生成3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)，dahp经过莽草酸途径依次生成莽草酸和分支酸，最终由分支酸通过l-苯丙氨酸/l-酪氨酸分支途径生成l-苯丙氨酸。
3、在大肠杆菌(escherichia coli)和酿酒酵母(saccharomyces cerevi
4、而大肠杆菌分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(ectyra)是tyra蛋白家族中高度差异化的一员。ectyra是分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶的双功能酶的一部分，由负责催化分支酸重排形成预苯酸的分支酸变位酶结构域(aroqt)和以nad+作为辅因子将预苯酸氧化脱羧成为羟基苯丙酮酸的ectyra结构域组成，由tyra基因编码。ectyra基因产物受到低浓度分支酸的激活作用。由于ectyra是合成l-酪氨酸的关键酶，因此增强tyra基因表达可以促进l-酪氨酸积累。但由于是竞争途径，因此tyra基因表达量提高不利于l-苯丙氨酸的合成。敲除tyra基因虽有利于l-苯丙氨酸积累，但会造成基因工程菌株无法自身合成基础代谢所需的l-酪氨酸，成为l-酪氨酸营养缺陷型。因此，在l-苯丙氨酸生产菌种发酵时，需要额外添加一定量的l-酪氨酸(刘艳华.大肠杆菌苯丙氨酸生物合成的调控研究[d].郑州：郑州大学，2010.)。
5、一般情况下，为了提高l-苯丙氨酸产量，会直接敲除tyra基因。这种方法会导致宿主菌不能自主合成l-酪氨酸，发酵生产时需额外添加一定量的l-酪氨酸。然而，额外添加l-酪氨酸时需要精准控制好添加时机和添加量，一旦添加时机和添加量不能精准操作，很容易造成l-苯丙氨酸减产甚至发酵失败。此外，额外添加l-酪氨酸会增加l-苯丙氨酸的生产成本。因此，现在急需一种方案，通过精准调控tyra基因表达量，精准控制胞内l-酪氨酸的合成代谢，在达到l-苯丙氨酸高产的情况下，不必向发酵培养基中额外补充l-酪氨酸。
6、近年来随着计算机运算能力的提升以及先进算法的涌现，计算机蛋白模拟逐渐成为蛋白质改造的常用手段。蛋白质改造设计的基础是蛋白质结构的信息，蛋白质结构的获得方法包括实验方法(x衍射、核磁共振或冷冻电镜)和计算机模拟(常见的同源建模软件有alphafold2、swiss-model、modeller等)。分子对接就是两个或多个分子之间通过几何匹配和能量匹配相互识别找到最佳匹配模式的过程。通过分子对接可以预测生物大分子与有机小分子的结合模式与亲和力，解释酶催化反应机理。
7、因此，提供ectyra蛋白突变体及其在提高l-苯丙氨酸产量中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了ectyra蛋白突变体及其在提高l-苯丙氨酸产量中的应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、ectyra蛋白突变体，为tyra-s176a、tyra-s176g、tyra-h197a、tyra-h197r或tyra-s176l；
4、所述ectyra蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
5、优选的，所述ectyra蛋白突变体为tyra-s176a。
6、进一步，所述的ectyra蛋白突变体的相关生物材料，为下述(1)-(4)中的至少一种：
7、(1)编码ectyra蛋白突变体的核酸分子；
8、(2)含有(1)所述核酸分子的表达盒；
9、(3)含有(1)所述核酸分子的重组载体或含有(2)所述表达盒的核酸分子的重组载体；
10、(4)含有(1)所述核酸分子的重组微生物、含有(2)所述表达盒的核酸分子的重组微生物或含有(3)所述重组载体的重组微生物。
11、进一步，所述的ectyra蛋白突变体或所述的相关生物材料在提高l-苯丙氨酸产量中的应用。
12、进一步，所述的ectyra蛋白突变体或所述的相关生物材料在制备提高l-苯丙氨酸产量制剂中的应用。
13、进一步，所述的ectyra蛋白突变体在制备提高l-苯丙氨酸产量的基因工程菌中的应用。
14、进一步，所述基因工程菌为phe01-tyra-s176g、phe01-tyra-h197a、phe01-tyra-h197r、phe01-tyra-s176a或phe01-tyra-s176l。
15、优选的，所述基因工程菌为phe01-tyra-s176a。
16、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了ectyra蛋白突变体及其在提高l-苯丙氨酸产量中的应用，根据已发表的tyra结构模型(haemophilusinfluenzae tyra，pdb：2pv7)，通过modeller建立蛋白结构模型，并通过autodock vina分子对接，最终建立tyra复合物的结构模型；该模型为tyra蛋白的理性改造提供依据。本专利技术是一种仅通过理性改造ectyr本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.EcTyrA蛋白突变体，其特征在于，为TyrA-S176A、TyrA-S176G、TyrA-H197A、TyrA-H197R或TyrA-S176L；
2.根据权利要求1所述的EcTyrA蛋白突变体，其特征在于，所述EcTyrA蛋白突变体为TyrA-S176A。
3.根据权利要求1所述的EcTyrA蛋白突变体的相关生物材料，其特征在于，为下述(1)-(4)中的至少一种：
4.权利要求1-2任一项所述的EcTyrA蛋白突变体或权利要求3所述的相关生物材料在提高L-苯丙氨酸产量中的应用。
5.权利要求1-2任一项所述的EcTyrA蛋白突变体或权利要求3所述的相关生物材料在制备提高L-苯丙氨酸产量制剂中的应用。
6.权利要求1-2任一项所述的EcTyrA蛋白突变体在制备提高L-苯丙氨酸产量的基因工程菌中的应用。
7.权利要求6所述的EcTyrA蛋白突变体在制备提高L-苯丙氨酸产量的基因工程菌中的应用，其特征在于，所述基因工程菌为PHE01-tyrA-S176G、PHE01-tyrA-H197A、PHE01-tyr
8.权利要求7所述的EcTyrA蛋白突变体在制备提高L-苯丙氨酸产量的基因工程菌中的应用，其特征在于，所述基因工程菌为PHE01-tyrA-S176A。
...【技术特征摘要】
1.ectyra蛋白突变体，其特征在于，为tyra-s176a、tyra-s176g、tyra-h197a、tyra-h197r或tyra-s176l；
2.根据权利要求1所述的ectyra蛋白突变体，其特征在于，所述ectyra蛋白突变体为tyra-s176a。
3.根据权利要求1所述的ectyra蛋白突变体的相关生物材料，其特征在于，为下述(1)-(4)中的至少一种：
4.权利要求1-2任一项所述的ectyra蛋白突变体或权利要求3所述的相关生物材料在提高l-苯丙氨酸产量中的应用。
5.权利要求1-2任一项所述的ectyra蛋白突变体或权利要求3所述的相关生物材料...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈民良，梁恒宇，周鹏，韩超，谢汝飞，谢国安，谭伟，张皓，
申请(专利权)人：河南省健康元生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。