FruR蛋白及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种FruR蛋白及其筛选方法和应用，属于合成生物学技术领域。本申请提供一种调控因子FruR蛋白，将工程菌中野生型fruR基因替换成本申请fruR基因，重组的工程菌在乙酰辅酶A、苹果酸、琥珀酸、延胡索酸、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖酸

【技术实现步骤摘要】
FruR蛋白及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术属于合成生物学
，具体涉及一种FruR蛋白及其制备方法和 应用。

技术介绍

[0002]L
‑
苯丙氨酸(L
‑
phenylalanine,英文简写PHE)，是最重要的芳香族氨基酸。 PHE的用途主要是作为苯丙素类化合物的前体，例如阿斯巴甜 (L
‑
phenylalanyl
‑
Laspartyl
‑
methyl ester)。
[0003]PHE主要通过经基因工程改造的大肠杆菌发酵合成。PHE的合成代谢受到多 维度的调控，其包括反馈抑制、阻遏抑制和衰减等等。因此，为了消除负调控 抑制以提高PHE产量，科研人员主要通过蛋白质改造等理性或者半理性策略改造 和调控蛋白，进而解除相关调控抑制。与此同时，科研工作者通过加强PHE合成 途径的关键基因表达，阻断竞争代谢途径和加强PHE向胞外转运效率等策略，以 提高大肠杆菌产PHE的能力。这些改造策略主要集中在PHE合成途径，但系统地、 全局地改造微生物代谢网络途径，特别是中心碳代谢途径，鲜有报道。
[0004]在大肠杆菌中，PHE合成起始于磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvicacid，英文简写PEP)和赤藓糖
‑4‑
磷酸(erythrose 4
‑
phosphate，英文简写E4P) 的缩合反应，这两个前体物质分别是中心碳代谢途径和磷酸戊糖途径的重要中 间代谢产物。因此，对中心碳代谢途径和磷酸戊糖途径的改造以增加上述两种 前体物质的积累，是PHE高产菌株遗传改造一种新的关键策略。在中心碳代谢途 径中，糖酵解和糖异生途径之间的碳代谢平衡主要受全局碳代谢调控因子FruR (又名Cra)调控。FruR的调控功能又受到胞内果糖
‑
1,6
‑
二磷酸(fructose 1,6 diphosphate，英文简写FDP)等诱导剂诱导调控。当不存在诱导剂时，FurR调控 因子与受调控的基因相结合，进而抑制参与糖酵解的基因并激活参与糖异生和 乙醛酸循环的基因；反之，当存在诱导剂时，FurR调控因子与受调控的基因解 离，并与诱导剂相结合，从而解除了受调控基因的被抑制和激活效应。基于上 述原理，可以通过改造FurR调控因子以激活糖异生途径和乙醛酸循环，从而增 加PEP和E4P的积累，最终促进PHE的生成。
[0005]目前，通过改造FurR调控因子进而促进PHE的生成的研究还未见有相关报 道。因此，本专利通过半理性改造FurR调控因子，并结合PHE响应的生物传感 器筛选出具有激活效应的FurR突变调控因子，对提高苯丙氨酸及上游代谢途径 中的代谢产物的产量有着十分重要的应用价值。
[0006]因此，如何提供一种FruR蛋白及其筛选方法和应用是本领域亟待解决的问 题。

技术实现思路

[0007]本专利技术公开了一种FruR蛋白及其筛选方法和应用。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]调控因子FruR蛋白突变体，包括以下突变之一：E173K、A18P、P129H、 I144T、
FruR
E173K
蛋白突变体相关的生物材料在提高乙酰辅酶A、苹果酸、琥珀酸、延 胡索酸、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖酸
‑6‑
磷酸、核糖
‑1‑
磷酸、莽草酸和苯丙氨 酸中的应用；
[0033]如上所述的调控因子FruR
E173K
蛋白突变体和权利要求2
‑
3所述的与调控因 子FruR
E173K
蛋白突变体相关的生物材料在制备提高乙酰辅酶A、苹果酸、琥珀 酸、延胡索酸、磷酸烯醇式丙酮酸、葡萄糖酸
‑6‑
磷酸、核糖
‑1‑
磷酸、莽草酸和 苯丙氨酸制剂中的应用；
[0034]如上所述的调控因子FruR蛋白突变体基因序列的筛选方法，其特特征在于， 方法为：
[0035]将苯丙氨酸的转录调控响应元件
‑
报告基因、fruR突变基因表达盒转入缺失 fruR基因的工程菌，通过报告基因的指示来选择可行性fruR突变基因；
[0036]优选的，所述苯丙氨酸的转录调控响应元件为色氨酸特异的转运蛋白启动 子；
[0037]优选的，报告基因为荧光报告基因；更优选的，所述荧光报告基因为红色 荧光蛋白；
[0038]FruR野生型DNA序列:
[0039]GTGAAACTGGATGAAATCGCTCGGCTGGCGGGAGTGTCGCGGACCAC TGCAAGCTATGTTATTAACGGCAAAGCGAAGCAATACCGTGTGAGCGACA AAACCGTTGAAAAAGTCATGGCTGTGGTGCGTGAGCACAATTACCACCCG AACGCCGTGGCAGCTGGGCTTCGTGCTGGACGCACACGTTCTATTGGTCTT GTGATCCCCGATCTGGAGAACACCAGCTATACCCGCATCGCTAACTATCTTG AACGCCAGGCGCGGCAACGGGGTTATCAACTGCTGATTGCCTGCTCAGAA GATCAGCCAGACAACGAAATGCGGTGCATTGAGCACCTTTTACAGCGTCA GGTTGATGCCATTATTGTTTCGACGTCGTTGCCTCCTGAGCATCCTTTTTATC AACGCTGGGCTAACGACCCGTTCCCGATTGTCGCGCTGGACCGCGCCCTC GATCGTGAACACTTCACCAGCGTGGTTGGTGCCGATCAGGATGATGCCGA AATGCTGGCGGAAGAGTTACGTAAGTTTCCCGCCGAGACGGTGCTTTATCT TGGTGCGCTACCGGAGCTTTCTGTCAGCTTCCTGCGTGAACAAGGTTTCCG TACTGCCTGGAAAGATGATCCGCGCGAAGTGCATTTCCTGTATGCCAACAG CTATGAGCGGGAGGCGGCTGCCCAGTTATTCGAAAAATGGCTGGAAACGC ATCCGATGCCGCAGGCGCTGTTCACAACGTCGTTTGCGTTGTTGCAAGGA GTGATGGATGTCACGCTGCGTCGCGACGGCAAACTGCCTTCTGACCTGGC AATTGCCACCTTTGGCGATAACGAACTGCTCGACTTCTTACAGTGTCCGGT GCTGGCAGTGGCTCAACGTCACCGCGATGTCGCAGAGCGTGTGCTGGAGA TTGTCCTGGCAAGCCTGGACGAACCGCGTAAGCCAAAACCTGGTTTAACG CGCATTAAACGTAATCTCTATCGCCGCGGCGTGCTCAGCCGTAG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.调控因子FruR蛋白突变体，其特征在于，包括以下突变之一：E173K、A18P、P129H、I144T、R312G、L3F
‑
L170N、S75I
‑
V160E、E72R
‑
P128A；调控因子FruR蛋白的氨基酸如SEQ ID NO.1所示；优选的，所述突变包括以下突变之一：E173K、A18P、P129H；优选的，所述突变为E173K。2.如权利要求1所述蛋白突变体的相关生物材料，为下述(1)
‑
(4)中的至少一种；(1)编码调控因子FruR蛋白突变体的核酸分子；(2)含有(1)所述核酸分子的表达盒；(3)含有(1)所述核酸分子的重组载体或含有(2)所述表达盒的核酸分子的重组载体；(4)含有(1)所述核酸分子的重组微生物、含有(2)所述表达盒的核酸分子的重组微生物或含有(3)所述重组载体的重组微生物。3.如权利要求2所述的生物材料，其特征在于，(4)中，所述含有(1)所述核酸分子的重组微生物、含有(2)所述表达盒的核酸分子的重组微生物或含有(3)所述重组载体的重组微生物为克隆菌株、穿梭菌株和工程菌株的一种或多种；优选的，所述克隆菌株为DH5α菌；优选的，所述工程菌为W3110ΔfruR。4.如权利要求1所述的调控因子FruR蛋白突变体或权利要求2
‑
3任一项所述的生物材料在提高苯丙氨酸产量、制备提高苯丙氨酸产量制剂中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的调控因子FruR蛋白的基因在缺失fruR基因的工程菌中表达；优选的，所述缺失fruR基因的工程菌为W3110。6.一种提高苯丙氨酸产量的试剂盒，其特征在于，包括：含有FruR蛋白突变体的核酸分子表达盒的表达载体；优选的，还包括缺失fruR基因的工程菌；优选的，所述缺失fruR基因的工程菌为W3110。7.如权利要求1所述的调控因子FruR
E173K
蛋白突变体和权利要求2
‑
3所述的生物材料在提高糖异生、糖酵解、乙醛酸循环、磷酸戊糖途径、PHE合成途径相关代谢酶的表达中的应用；优选的，所述糖异生相关代谢酶包括：6
‑
磷酸葡萄糖异构酶、果糖
‑1‑6‑
双磷酸酶、磷酸甘油酸变位酶和磷酸烯醇式丙酮酸合酶中的一种或多种...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈民良，梁恒宇，谢国安，刘泳宇，韩超，周鹏，范子灵，幸志伟，张皓，
申请(专利权)人：河南省健康元生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：