一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用。属于基因编辑技术领域。本发明专利技术通过对产黄枝顶头孢霉AcfaeB基因进行敲除，避免了将CPC水解为DCPC，从而提高CPC发酵产量，降低了其副产物DCPC的产量。利用本发明专利技术的产黄枝顶头孢霉AcfaeB基因及其编码的蛋白质能够有效促进头孢菌素C的合成速率和产量，具有很好的工业应用前景。具有很好的工业应用前景。具有很好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，更具体的说是涉及一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]头孢菌素C(Cephalosporin C，英文缩写CPC)是自然界中发现的第二种β
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内酰胺类抗生素，也是生产头孢类抗生素重要中间体7
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氨基头孢烷酸(7
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ACA)的主要骨架原料。CPC能够抑制细菌细胞壁合成，但其抗菌活性较低。目前，工业上主要利用产黄支顶孢霉(Acremonium chrysogenum，英文缩写Ac)发酵生产CPC。经过多年研究，CPC在产黄支顶孢霉中的生物合成途径已经基本清楚，这为利用基因工程手段改造这一重要的工业丝状真菌奠定了良好基础。
[0003]在CPC发酵过程中会产生青霉素N(PenicillinN，英文缩写PEN)、去乙酰氧头孢菌素C(Deacetoxycephalosporin C，英文缩写DAOC)、去乙酰头孢菌素C(Deacetyl Cephalosporin C，英文缩写DCPC)等中间代谢产物。其中DCPC为最主要的副产物，其结构与性质和CPC极为相似。发酵生产过程中DCPC的质量分数约为CPC质量分数的10％～30％。在目前主流的生产工艺中，DCPC虽能够与主产物CPC进行分离，但大量DCPC的积累不仅消耗发酵原料，其在余液中的残留还会造成环境污染，对工厂下游环保造成巨大压力。虽然目前已有学者对CPC废液中副产物的降低或再利用进行了一些研究，但因可操作性与经济效益低等问题，能真正应用于实际生产的工艺仍然很少。
[0004]以RNA介导的CRISPR系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，简写CRISPR)作为第三代基因组编辑技术，因其在基因编辑和基因修饰方面具有效率最高、成本最低和操作简便等优势。CRISPR技术在真菌遗传育种方面也具有重要应用前景，成为当前真菌功能基因组研究与遗传改造的研究热点。丝状真菌成熟基因编辑平台的构建，对挖掘这类微生物在工业、农业、医药等多种行业的应用价值与潜力起关键作用。在此基础上，通过中断宿主非同源末端连接的关键基因和精妙的同源重组供体设计，使得CRISPR/Cas系统能在特定位点引入变化，提高了基因编辑的精准性。
[0005]DCPC在发酵液中的积累有两个主要原因：一、产黄支顶孢霉自身DCPC乙酰转移酶表达基因(cefG)启动子强度不足，转录量低，使DCPC无法有效向下转化为CPC，成为生产过程中的限速步骤之一；二、目前已知且唯一被研究过的CPC乙酰水解酶基因(cahB)存在于产黄支顶孢霉
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号染色体上。cahB可表达1.4kb的单链转录子，翻译出的乙酰水解酶(CPCAH)属于丝氨酸蛋白酶家族，可将发酵液中的CPC水解为DCPC，该酶活性随着发酵过程表达水平会持续下降，但有研究表明即使发酵144h后仍能检测到其活性。但最近有研究表明，单纯敲除cahB基因并不能显著降低产黄支顶孢霉菌株的DCPC产量(徐燕，冯涛，储炬.利用CRISPR/Cas9系统构建低DCPC杂质含量的CPC工业高产菌种[J].华东理工大学学报(自然科学版)，2021,47(4):427
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437.)，因此有学者推测还有其他类似基因表达产物具有将CPC水解为DCPC的乙酰水解酶活性。
[0006]综上，如何提供一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用。
[0008]针对现有头孢菌素C生产菌种在发酵过程中主要副产物脱乙酰基头孢菌素C(DCPC)产量较高从而导致的CPC上游发酵碳源利用率较低，而下游分离提取成本较高的难点，本专利技术首先要解决的技术问题是筛选到一种新的头孢菌素C乙酰水解酶基因，该基因是产黄支顶孢霉编码基因KFH42174.1，被命名为AcfaeB。
[0009]本专利技术其次要解决的技术问题是提供一株利用CRISPR/Cas9技术敲除AcfaeB编码基因KFH42174.1的产黄支顶孢霉基因编辑工程菌。
[0010]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述产黄支顶孢霉基因编辑基因工程菌的构建方法。
[0011]本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述产黄支顶孢霉基因编辑工程菌的应用。
[0012]为了克服上述技术问题和不足，本专利技术首先结合系统生物学数据和生物信息学预测工具进行基因挖掘，然后对疑似具有CPC乙酰水解酶活性的基因进行毕赤酵母表达，对可溶性表达的蛋白进行CPC体外水解去乙酰化能力进行研究，从中筛选得到一种新型阿魏酸酯酶B类蛋白(Feruloyl esterase B
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like protein)样基因的表达产物具有体外CPC乙酰水解酶活性，能够实现胞外分泌表达并水解CPC为DCPC。本专利技术将上述基因命名为AcfaeB。本专利技术还对产黄支顶孢霉AcfaeB基因进行了基因敲除，并对基因编辑后的基因工程菌的应用进行了研究。研究结果表明，敲除产黄支顶孢霉AcfaeB基因能够显著提高CPC的产量，同时大幅减少主要副产物DCPC的生成量。
[0013]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0014]一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID:NO.2所示，且该蛋白具有头孢菌素C乙酰水解酶活性。
[0015]MGNFRVTRSLAGLLTLGSSALAQLQNIPNFGNNPTGLSMDVYVPSNPPESPAVVLALHPCGGSGGGYAGQTGYTSIADQKGFIAIFPSSFRDMNCWDVASQASLTRDGGGDSTGLASMVQYALETWNADPDRIFVTGSSSGCMMTNVMSAAYPDLFAAASCYSGVAAGCLKGSPGSSPISADPTCANGEINLSAEEWAQRARDIYPGYSGSYPRFMTLHGTADWLVRIPNLEQQLMQWSTLHGVEQTASNPNTPQNGYTQLVYGDGTQLVGYSAEGVGHTVPVNSNLDMEWFGL，SEQ ID:NO.2。
[0016]进一步的，所述蛋白由SEQ ID:NO.1所示的核苷酸序列编码而成。
[0017]ATGGGCAACTTCCGAGTCACACGGAGCCTTGCAGGTCTCCTTACGCTGGGCTCTTCAGCACTGGCCCAGCTGCAAAACATCCCCAACTTCGGCAACAACCCCACGGGCCTCTCCATGGACGTCTATGTCCCATCCAACCCCCCGGAGAGCCCTGCCGTGGTTCTGGCTCTCCATCCTTGCGGTGGTAGCGGTGGTGGCTATGCCGGGCAGACAGGCTACACTTCGATTGCGGACCAGAAGGGTTTCATCGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID:NO.2所示，且该蛋白具有头孢菌素C乙酰水解酶活性。2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白由SEQ ID:NO.1所示的核苷酸序列编码而成。3.AcfaeB基因或其编码的蛋白在发酵生产头孢菌素C中的应用，其特征在于，AcfaeB基因的核苷酸序列如SEQ ID:NO.1所示；AcfaeB基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID:NO.2所示。4.AcfaeB基因或其编码的蛋白在头孢菌素C发酵生产过程中降低去乙酰头孢菌素C副产物产量积累的应用，其特征在于，AcfaeB基因的核苷酸序列如SEQ ID:NO.1所示；AcfaeB基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID:NO.2所示。5.高产头孢菌素C的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过对产黄枝顶头孢霉的AcfaeB基因进行敲除获得，所述AcfaeB基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁恒宇，周鹏，李雪亮，韩超，陈民良，郭慧萍，张敏，杨梦园，侯剑桥，张皓，
申请(专利权)人：河南省健康元生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：