一种短糖链修饰的IsPETase及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种短糖链修饰的IsPETase及其制备方法和应用，其制备方法具体为：先构建IsPETase多拷贝串联表达载体，再将IsPETase多拷贝表达载体转化宿主细胞，发酵后收集上清，其中所述宿主细胞为真核生物细胞，采用滤膜过滤上清，然后加入Endo H进行反应即得。本发明专利技术所得的重组IsPETase具有短糖链修饰且具备高热稳定性和高活性，而且该制备方法通过基因剂量效应和高密度表达能有效提高产量，适用于工业化生产。适用于工业化生产。适用于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种短糖链修饰的IsPETase及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种短糖链修饰的IsPETase(来源于Ideonellasakaiensis的PET塑料降解酶)以及其制备方法和在PET(Polyehylene terephthalate)塑料的生物降解中的应用。

技术介绍

[0002]由于石油化学产品的低成本及塑料的广泛使用，塑料的生产量大幅增加。其中只有一小部分被回收利用，大部分被掩埋进土壤或焚烧。因合成塑料难以被生物降解，排放到环境中的塑料废弃物会在自然界中积累，对环境产生有害影响。如土壤中的塑料堆积会造成土壤板结，使土壤通透性降低；水体中的微塑料更是会进入水生食物链，最终影响人类的身体健康。因此如何通过绿色环保的方式处理塑料废弃物一直是世界难题。
[0003]通过生物降解法使得塑料废弃物中的高分子聚物分解成低聚物或者单体的方法相对环保，不会造成二次污染。其中，PET塑料的生物降解已经取得了令人瞩目的进展。2016年，日本科学家从一家PET回收工厂分离出一株利用PET塑料作为主要碳源的细菌Ideonellasakaiensis 201
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F6，并从中鉴定了一个PET塑料酶，名为IsPETase，该酶可在常温下将PET降解为单(2
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羟乙基)对苯二甲酸酯(MHET)、对苯二甲酸(TPA)和乙二醇。但是IsPETase的热稳定性差，反应温度低，严重的削弱了它在实际应用中的效果。因此，多个实验室采用机器学习和理性设计的方法对IsPETase进行了改造并获得了热稳定性显著提高的PET降解酶，如Thermo
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PETase，FAST
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PETase等。但是如何大规模，低成本制备IsPETase及其突变体，从而应用于工业化生产还未见报道。
[0004]前期有报道(General features to enhance enzymatic activity of poly(ethylene terephthalate)hydrolysis，Nature Catalysis,4:425
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430,2021)成功采用毕赤酵母重组表达系统进行了IsPETase的分泌表达，并发现用EndoH去糖基化后的重组IsPETase具有比大肠杆菌重组表达的IsPETase更高的比活性。但是该报道中使用的是单拷贝表达质粒，目的基因表达水平较低，并且采用商品化的EndoH进行去糖基化，价格昂贵，不具备工业应用价值。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的问题，本专利技术的目的在于提供一种制备重组IsPETase的方法，所得重组IsPETase具有短糖链修饰且具备高热稳定性，而且该制备方法通过基因剂量效应和高密度表达能有效提高产量，适用于工业化生产。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术首先提供了一种制备短糖链修饰IsPETase的方法，包括如下步骤：
[0008]步骤一、构建IsPETase多拷贝串联表达载体；
[0009]步骤二、将IsPETase多拷贝表达载体转染宿主细胞，发酵后收集上清；其中所述宿主细胞为真核生物细胞；
[0010]步骤三、采用滤膜过滤上清，然后加入Endo H进行反应。
[0011]进一步地，在上述技术方案中，IsPETase多拷贝串联表达载体中的IsPETase基因拷贝数为2～4。
[0012]更进一步地，在上述技术方案中，构建IsPETase多拷贝串联表达载体的方法具体为：将IsPETase基因构建至表达载体中获得单拷贝表达载体，然后将单拷贝表达载体中的表达盒式结构用BamHI和SpeI切割回收后，再连接到用XbaI线性化的单拷贝表达载体中获得2拷贝表达载体，重复上述方法即可获得更多拷贝数的表达载体。
[0013]进一步地，在上述技术方案中，IsPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其氨基酸序列为在SEQ ID NO:1所示序列中存在一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代但功能结构域相同的序列，如在某一具体的实施例中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014]进一步地，在上述技术方案中，宿主细胞为毕赤酵母菌，当然在实际生产过程中也可采用其他的真核生物表达系统进行IsPETase的表达。
[0015]进一步地，在上述技术方案中，步骤二所述发酵为高密度发酵，具体为：将菌株扩培后转移至含有BSM培养基的发酵罐中，待甘油耗尽后向发酵罐中补充含PTM1微量盐的甘油，并将DO维持在20％以上，当发酵罐中细胞的湿重增加至180g/L时，加入甲醇诱导表达。更进一步地，甲醇加入的终浓度为5～10mL/L。
[0016]进一步地，在上述技术方案中，Endo H的加入量为0.1％～1.0％(w/w)，且反应条件为28～37℃、0.5～2h。更进一步地，在上述技术方案中，Endo H可以直接使用毕赤酵母分泌表达Endo H的上清液，不需做其他任何处理。
[0017]本专利技术第二方面提供了根据上述方法制备的具有短糖链修饰的IsPETase，在上述制备过程中，IsPETase基因经真核表达系统表达所得的重组酶蛋白上附加有大量的不同长度的糖链，在经过Endo H短时间处理后，重组酶蛋白中仍能保留少量的短糖链。
[0018]本专利技术第三方面提供了短糖链修饰的IsPETase在PET塑料降解中的应用，由于短糖链修饰后的IsPETase具有很高的热稳定性和高活性，可以在50℃条件下有效降解PET塑料。
[0019]现对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0020]本专利技术发现通过真核表达系统和Endo H联用可产生带有短糖链的IsPETase，这种修饰后的IsPETase的最适反应温度和热稳定性显著提高，可以在50℃有效降解PET塑料。与此同时，本专利技术发现采用多拷贝表达的基因剂量效应可有效提高了IsPETase在真核宿主中的表达水平，进一步配合高密度发酵，实现了IsPETase的工业化水平制备，能够满足工业上水解回收废弃塑料时对酶的大量需求。此外，本专利技术中可以使用毕赤酵母分泌表达Endo H的上清直接进行去糖基化，方法简便，无需繁琐的纯化步骤，适合大规模酶制剂生产要求。进一步研究表明，该方法也是用于IsPETase突变体的制备。
附图说明
[0021]图1为实施例1中IsPETase多拷贝重组毕赤酵母表达菌株摇瓶表达所得上清的SDS
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PAGE图；
[0022]图2为实施例1中携带IsPETase 4拷贝的毕赤酵母菌株高密度发酵所得上清的SDS
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PAGE图；
[0023]图3为实施例1中经毕赤酵母表达所得重组IsPETase的糖基化位点示意图；
[0024]图4为去糖基化后的重组IsPETase的SDS
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PAGE图；
[0025]图5为实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备短糖链修饰IsPETase的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、构建IsPETase多拷贝串联表达载体；步骤二、将IsPETase多拷贝表达载体转染宿主细胞，发酵后收集上清；其中所述宿主细胞为真核生物细胞；步骤三、采用滤膜过滤上清，然后加入Endo H进行反应。2.根据权利要求1所述制备短糖链修饰IsPETase的方法，其特征在于，所述IsPETase多拷贝串联表达载体的IsPETase基因拷贝数为2～4。3.根据权利要求2所述制备短糖链修饰IsPETase的方法，其特征在于，步骤一具体为：将IsPETase基因构建至表达载体中获得单拷贝表达载体，然后将单拷贝表达载体中的表达盒式结构用BamHI和SpeI切割回收后，再连接到用XbaI线性化的单拷贝表达载体中获得2拷贝表达载体，重复上述方法即可获得更多拷贝数的表达载体。4.根据权利要求1所述制备短糖链修饰IsPETase的方法，其特征在于，所述IsPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其氨基酸序列为在SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟超，马立新，邓斌阳，岳宇，杨军，王飞，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：