一种重组酯酶、编码基因、工程菌及在生产R-酮洛芬中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组酯酶、编码基因、工程菌及在生产R

【技术实现步骤摘要】
一种重组酯酶、编码基因、工程菌及在生产R
‑
酮洛芬中的应用
(一)

[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及来源假单胞菌(Pseudomonas sp.)的重组酯酶、编码基因及在拆分(R,S)
‑
酮洛芬乙酯生产(R)
‑
酮洛芬中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]酮洛芬，又称为酮基布洛芬，化学名称为α
‑
甲基
‑3‑
苯甲酰基苯乙酸，属于2
‑
芳基丙酸类非甾体抗炎药物；是目前临床上常用的一类镇痛抗炎的非甾体药物。酮洛芬是一种外消旋混合物，其中S
‑
异构体可以抑制环氧合酶(COX
‑
2)从而具有消炎作用，R
‑
异构体也具有一定的药用价值，它在对于牙周病的骨质疏松方面有治疗作用。Ossipov等人探讨了外消旋酮洛芬及对映体在大鼠神经性疼痛和强直性疼痛模型中的脊柱活性，并指出R
‑
酮洛芬对抗神经性疼痛的作用机制不涉及COX抑制，在抗触觉性异常疼痛方面也发挥着重要作用。Seonghun等人从Bacillus stearothermophilusJY144和刘瑞恩等人从Bacillus megaterium NK13分别筛出可以立体选择性拆分外消旋酮洛芬酯类物质生成R
‑
酮洛芬的酯酶。前者催化外消旋酮洛芬乙酯水解，转化率50％时产物ee
p
>98％；后者催化外消旋酮洛芬氯乙酯水解，转化率30％时产物ee
p
达60.78％。目前对于光学纯酮洛芬的研究报道多集中于S
‑
酮洛芬，对于立体选择性拆分生成R
‑
酮洛芬的报道较少。
[0003]目前光学纯酮洛芬的生产主要是以化学法生产为主，而生物酶法拆分生产手性化合物具有操作简便、绿色环保、反应条件温和，生产安全性较高等优点。
[0004]本专利技术将公开一种新的酯酶基因序列和它的功能，该酶能够选择性催化水解(R,S)
‑
酮洛芬乙酯生产R
‑
酮洛芬。
(三)
技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种重组酯酶、编码基因、工程菌及在拆分(R,S)
‑
酮洛芬乙酯制备R
‑
酮洛芬中的应用，该酯酶在催化(R,S)
‑
酮洛芬乙酯的水解中具有较好的R
‑
对映体选择性和反应活性，操作简便、绿色环保、反应条件温和，生产安全性较高。
[0006]本专利技术采用的技术方案：
[0007]本专利技术提供一种来源于假单胞菌(Pseudomonas sp.)的重组酯酶(记为GE02212)，所述重组酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]本专利技术所述假单胞菌优选为假单胞菌(Pesudomonas sp.)zjut126，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年10月30日，保藏编号CCTCC NO：M2017635，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，已在专利申请CN109321487A中公开。
[0009]本专利技术还涉及所述重组酯酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0010]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在80％以上，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基
酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0011]本专利技术还提供含所述重组酯酶编码基因的重组质粒(优选为GE02212
‑
pET
‑
28a(+))，及由所述重组质粒转化获得的重组基因工程菌(优选为GE02212
‑
pET
‑
28a(+)
‑
E.coli BL21Gold(DE3))。
[0012]此外，本专利技术还提供一种所述重组酯酶在水解(R,S)
‑
酮洛芬乙酯生成R
‑
酮洛芬中的应用，具体所述的应用：将含重组酯酶编码基因的工程菌经诱导发酵得到的湿菌体用缓冲液重悬后超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以(R,S)
‑
酮洛芬乙酯为底物，以pH7.0
‑
9.0的缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在20～60℃、120～240rpm(优选30℃、200rpm)条件下进行水解拆分反应，获得R
‑
酮洛芬。
[0013]优选的，所述反应介质优选为pH8.0、50mM的Tris
‑
HCl的缓冲溶液；所述底物加入量以反应体系总体积计为0.5
‑
35g/L，优选1g/L；所述催化剂用量以蛋白含量计为0.16
‑
0.9mg/L，优选0.3mg/L。
[0014]进一步，所述催化剂按如下方法制备：(1)将湿菌体用冰预冷的pH8、50mM的Tris
‑
HCl缓冲液重悬，获得菌悬液；菌悬液在0
‑
4℃、350
‑
450W条件下超声破碎10
‑
15min，超声破碎期间工作2s、间歇3s；将获得的破碎液在4℃、8000rpm离心10min，收集上清液；(2)步骤(1)上清液上样经含10mM咪唑的pH7.5的PB缓冲液平衡的Ni
‑
NTA亲和层析柱，以1mL/min的速度上样，上样结束后，先用含20mM咪唑的pH7.5的PB缓冲液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线，再用含250mM咪唑的pH7.5的PB缓冲液一步法洗脱目的蛋白，收集含有目的蛋白的洗脱液，透析、浓缩，获得重组酯酶的纯酶液。
[0015]优选的，所述菌悬液中湿菌体浓度0.5
‑
35g/L(优选10g/L)。所述超声破碎条件为4℃、400W、10min。
[0016]所述的湿菌体按以下步骤获得：将含有重组酯酶编码基因的工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，200rpm的摇床中培养12
‑
16h，获得种子液；再将种子液按照体积浓度为1％的接种量转接至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD
600
为0.6
‑
0.8，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG，置于25℃摇床中200rpm诱导发酵10
‑
12h，发酵液经离心，沉淀即为湿菌体。
[0017]与现有的技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：
[0018本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于假单胞菌(Pseudomonas sp.)的重组酯酶，其特征在于，所述重组酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.一种权利要求1所述重组酯酶的编码基因。3.一种含权利要求2所述重组酯酶编码基因的重组质粒。4.一种由权利要求3所述重组质粒转化获得的重组基因工程菌。5.一种权利要求1所述重组酯酶在水解(R,S)
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酮洛芬乙酯生成R
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酮洛芬中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用为：将含重组酯酶编码基因的工程菌经诱导发酵得到的湿菌体用缓冲液重悬后超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以(R,S)
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酮洛芬乙酯为底物，以pH7.0
‑
9.0的缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在20～60℃、120～240rpm条件下进行水解拆分反应，获得R
‑
酮洛芬。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应介质为pH8.0、50mM的Tris
‑
HCl的缓冲溶液；所述底物加入量以反应体系总体积计为0.5
‑
35g/L；所述催化剂用量以蛋白含量计为0.16
‑
0.9mg/L。8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：(1)将湿菌体用冰预冷的pH8、50mM的Tris
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【专利技术属性】
技术研发人员：张朝晖，周莹莹，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：