一种角质酶突变体及其在合成1，4-二乙酰哌嗪中的应用制造技术

一种角质酶突变体及其在合成1，4

【技术实现步骤摘要】
一种角质酶突变体及其在合成1，4
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二乙酰哌嗪中的应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种角质酶突变体及其在合成1，4
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二乙酰哌嗪中的应用。

技术介绍

[0002]哌嗪是一种重要的医药中间体，可合成磷酸哌嗪、胍哌、依诺沙星等几十种药物，还可用于生产湿润剂、乳化剂、分散剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、塑料加工和橡胶助剂等。哌嗪修饰的药物及功能试剂，主要通过酰化反应实现哌嗪分子的引入。哌嗪具有两个仲胺结构，通过乙酰化修饰、脱乙酰化反应，可实现两个仲胺分别连接不同的官能团，能够极大丰富药物结构种类，并显著影响该类化合物的药代动力学性质。因此，哌嗪的乙酰化反应，尤其是1，4
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二乙酰哌嗪类化合物的构建对上述药物及功能试剂具有重要意义。目前1，4
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二乙酰哌嗪的制备主要是利用传统化学法，该过程需要偶联试剂对羧酸活化，形成酰氯、酸酐、酰基叠氮化物等活性中间体，活性中间体进一步与胺进行亲核取代从而形成酰胺。但这种方法转化率很低，且要用到许多腐蚀性和毒性很大的试剂，导致原子经济性差。在绿色化学的要求下，迫切需要一种新的方法合成1，4
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二乙酰哌嗪类化合物。
[0003]近年来，生物催化(酶催化)作为一种可持续的技术得到了普及，不需要任何保护或脱保护步骤，通常具有很高的对映选择性，可以在温和的条件下进行。本专利技术所使用的角质酶，属于α/β水解酶，具有角质酶特征性的甘氨酸(Gly)
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酪氨酸(Tyr)
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丝氨酸(Ser)谷氨酰胺(Gln)
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甘氨酸(Gly)氨基酸序列以及丝氨酸(Ser)
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组氨酸(His)
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天冬氨酸(Asp)催化三联体，能够高效的催化脱水/水解反应。相对于脂肪酶，绝大多数角质酶没有脂肪酶结构中的“盖子”，因此角质酶的催化关键氨基酸丝氨酸暴露于溶剂；另外，角质酶催化三联体一般位于由疏水氨基酸包围的表面沟槽中，有利于容纳底物。这就为角质酶带来了较广的底物范围，如聚酯的聚合及降解，同时这一特性也为1，4
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二乙酰哌嗪的生物催化制备提供了更多可能。
[0004]然而，由于酶催化具有温和性，该特点限制了酶在工业化中的应用。为获得更理想的催化活性或更广泛的反应条件，还需要在野生型的基础上，通过化学修饰改造、针对酶分子结构的非理性和理性设计等方法对现有的酶进行修饰改造。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对针对野生型角质酶对哌嗪类氮杂环底物识别性差、催化活性低的问题，在原有角质酶序列(原有角质酶来源于米曲酶(Aspergillusoryzae)，氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示)基础上进行突变，提供了一种具有更高催化效率的角质酶突变体。
[0006]本专利技术的具体技术方案如下：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种提高1，4
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二乙酰哌嗪产率的角质酶突变体，所述角质酶突变体为下述突变体中的任意一种：
[0008]突变体cuitinaseM1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0009]突变体cuitinaseM2，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供上述角质酶突变体的编码序列：
[0011]所述突变体cuitinaseM1的编码序列如SEQ ID NO.3所示；
[0012]所述突变体cuitinaseM2的编码序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]本专利技术的第三个目的是提供含有上述编码序列的重组载体。
[0014]本专利技术的第四个目的是提供含有上述重组载体的重组菌。
[0015]本专利技术的第五个目的是提供上述角质酶突变体、编码序列、重组载体或重组菌在合成1，4
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二乙酰哌嗪中的应用。
[0016]本专利技术的第六个目的是提供一种合成1，4
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二乙酰哌嗪的方法，所述方法是将哌嗪和乙酰基供体溶于溶剂中，加入上述的角质酶突变体，催化获得1，4
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二乙酰哌嗪。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述哌嗪浓度为0.1～5g/L；所述乙酰基供体为乙烯乙酸酯；所述乙烯乙酸酯与哌嗪的物质的量之比为2.2～3：1；所述角质酶的浓度为0.1～10mg/L。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述溶剂为N,N
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二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、四氢呋喃、正己烷、乙酸乙酯和水中的任意一种或两种以上的混合物。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述催化的反应温度为20～50℃，反应时间为0.5～24h。
[0020]本专利技术的第七个目的是提供一种制备上述角质酶突变体的方法，包括如下步骤：
[0021](1)构建含编码所述角质酶突变体的基因的质粒载体；
[0022](2)将突变体质粒导入大肠杆菌BL21中；
[0023](3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清即为角质酶突变体的粗酶液；
[0024](4)利用镍柱对粗酶液进行蛋白纯化，得到目的蛋白，再使用超滤管进行浓缩，得到纯化酶。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述突变体质粒为pET
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28a
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cutinaseM1或pET
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28a
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cutinaseM2。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)所述发酵培养是指使用LB
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kana液体培养基于37℃条件下培养重组大肠杆菌至OD
600
于0.6至0.8之间，进行诱导得发酵液。
[0027]在本专利技术的一种实施方式中，所述诱导的条件为加入终浓度0.5mM的IPTG，于16℃温度下诱导16h。
[0028]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)所述细胞破壁上清的获得方法是将发酵液离心，舍上清液，菌体使用PBS缓冲液重悬，并重复离心步骤两次，得到重组大肠杆菌悬浮液，使用高压细胞破碎仪将菌体破碎，并于一定条件下离心，舍弃沉淀，即得细胞破壁上清。
[0029]在本专利技术的一种实施方式中，所述离心条件为4℃、8000rpm条件下离心5min。
[0030]在本专利技术的一种实施方式中，步骤(4)所述蛋白纯化过程需要配置纯化蛋白所需溶剂，所需溶剂配置方法如下：准确称量8.95gNa2HPO4·
12H2O、8.766gNaCl、0.3404g咪唑于500mLUP水中得到BindingBuffer；准确称量8.95gNa2HPO4·
12H2O、8.766gNaCl、1.5318g咪唑于500mLUP水中得到WashingBuffer；准确称量8.95gNa2HPO4·
12H2O、8.766gNaCl、17.02g咪唑于500mLUP水中得到El本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高1，4
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二乙酰哌嗪产率的角质酶突变体，其特征在于，所述角质酶突变体为下述突变体中的任意一种：突变体cuitinaseM1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；突变体cuitinaseM2，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种权利要求1所述角质酶突变体的编码序列，其特征在于，所述突变体cuitinaseM1的编码序列如SEQ ID NO.3所示；所述突变体cuitinaseM2的编码序列如SEQ ID NO.4所示。3.含有权利要求2所述编码序列的重组载体。4.含有权利要求3所述重组载体的重组菌。5.权利要求1所述角质酶突变体、权利要求2所述编码序列、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组菌在合成1，4
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二乙酰哌嗪中的应用。6.一种合成1，4
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二乙酰哌嗪的方法，其特征在于，所述方法是将哌嗪和乙酰基供体溶于溶剂中，加入权利要求1所述的角质酶突变体，催化...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，徐超，姜龙，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：