大肠杆菌膜蛋白ZraS突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法与应用技术

本发明专利技术提供大肠杆菌双组分调控系统膜蛋白ZraS突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法与应用。所述突变体包括S154T、A214S、Q313R、T415A中的一种或几种。这些突变体的制备方法包括：构建SP

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌膜蛋白ZraS突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及大肠杆菌膜蛋白ZraS突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法与应用。

技术介绍

[0002]铅是一种在自然界广泛分布的环境重金属污染物，土壤、空气和水源中都不同程度地含有一定量的铅，这些铅会通过空气、水源和土壤进入我们的食物中。食物中的铅主要是由环境污染带入食品原料，从而通过膳食摄入体内。所以，食物中铅超标，多是由于生产企业对原料把关不严格，使用了铅含量超标的原料，当然也不排除从生产设备迁移入食品的可能。铅在体内半衰期较长，故可长期在体内蓄积。若体内铅含量超标，吸收到血液中的铅会对生物体内许多器官组织都具有不同程度的损害作用，尤其对造血系统、神经系统和肾脏的损害尤为明显。作为一种对人类健康具有严重威胁的一种重金属，食品中铅的检测尤为重要。
[0003]随着环境污染的严峻及人们对生活质量要求的提高，对食品来源及其安全性越来越重视，尤其需要对其中含有的重金属、抗生素等有害成分进行严格把控。目前常用的检测方法，一般是将样品前处理技术和色谱、质谱分离分析技术集成；此外还有化学定性检测、酶抑制、基于抗原抗体识别的ELISA酶联反应、表面等离子共振、光纤信号转导放大等技术，在国内外的农产品与食品安全检测中逐渐得到应用。然而，已有检测方法未尽如人意，存在应用面不广、实验操作较复杂、大规模检测成本较高等局限。
[0004]在原核细胞中，作为外部刺激与细胞应激偶联的重要机制，双组分调控系统一般由膜上的组氨酸激酶受体(Sensor histidine kinase,HK)与胞内的应答调控蛋白(Response regulator,RR)组成，HK负责感应外部信号，RR负责调控靶基因的表达。HK被外部刺激激活后将自身的一个组氨酸磷酸化，然后将磷酸基团传递到应答调控蛋白RR上的一个天冬氨酸上并激活，激活后的RR调控靶基因的表达；这是一套天然的信号转导系统，快速地将胞外刺激信号转导到胞内的基因表达应答。以双组分调控系统为核心，以微生物细胞作为传感器检测主体，将微生物细胞与理化检测器结合，利用微生物细胞对于重金属灵敏感应，输出颜色的、荧光的或冷光的信号，并采用分光光度计、酶标仪等器材读取检测结果。双组分调控系统作为信号转导环节具有两大优越性：
①
微生物活细胞自发提供了信号转导所需的各调控蛋白元件，无需额外购买试剂，成本低廉；
②
微生物活细胞通过细胞膜将胞外的环境波动与胞内的报告基因表达有效隔离，因此系统的稳健性将显著优于酶促反应，对被测样品前处理或纯度的要求大大降低。
[0005]大肠杆菌双组分调控系统ZraS
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ZraR可识别和感应胞外金属铅和锌离子，当胞外存在铅离子时，膜蛋白ZraS识别离子信号，随即激活调控蛋白ZraR使其磷酸化，磷酸化的ZraR调控蛋白与ZraP启动子上游的识别位点结合，诱导靶基因ZraP的表达。利用该系统对铅离子或锌离子检测具有高效性及特异性，是理想的微生物检测器。鉴于铅对人体的危害
性，检测农产品中铅的含量具有更大的应用价值及意义。但在实际应用过程中，待测样品往往成分复杂，且可能两种离子会同时存在，而该系统无法将铅离子和锌离子特异区分。另一方面，据文献报道，应用大肠杆菌双组分调控系统ZraS
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ZraR对铅的检测范围为 0.3～1.0mM；然而，据国家铅限量标准，食品中铅的含量普遍低于 1.0mg/kg(0.0048mM)，使用野生型系统难以实现检测目标。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术旨在提供大肠杆菌膜蛋白ZraS突变体、编码所述突变体的基因、重组载体及制备方法与应用。针对大肠杆菌膜蛋白ZraS 的特异性进行定向进化，使该系统在保留对铅离子识别能力的同时，提高其对铅离子的识别敏感性，且降低甚至失去对锌离子的识别能力，从而达到该系统特异检测铅离子的目标。利用噬菌体辅助连续定向进化的方法(PACE)对膜蛋白 ZraS的底物特异性进行正筛和负筛的交替进化，从而提供一种能灵敏识别胞外铅离子的受体膜蛋白，使其能够灵敏检测重金属铅离子，进化后的膜蛋白ZraS 能应用于农产品中铅的定量检测。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了大肠杆菌膜蛋白ZraS突变体，所述突变体包括S154T、A214S、 Q313R、T415A中的一种或几种；
[0009]其中，大肠杆菌膜蛋白ZraS的第154位氨基酸S突变为T得到突变体S154T；
[0010]大肠杆菌膜蛋白ZraS的第214位氨基酸A突变为S得到突变体A214S；
[0011]大肠杆菌膜蛋白ZraS的第313位氨基酸Q突变为R得到突变体Q313R；
[0012]大肠杆菌膜蛋白ZraS的第415位氨基酸T突变为A得到突变体T415A。
[0013]本专利技术还提供了编码上述突变体的基因。
[0014]本专利技术还提供了包含上述基因的表达载体。
[0015]进一步地，所述表达载体中ZraS基因的启动子为内源性启动子ZraSp。
[0016]本专利技术还提供了包含上述基因的重组质粒。
[0017]本专利技术还提供了包含上述重组质粒的重组细胞。
[0018]本专利技术还提供了上述膜蛋白ZraS突变体的制备方法，包括：构建SP
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ZraS 噬菌体；采用噬菌体辅助连续定向进化方法(PACE)通过正筛与负筛交替进化 SP
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ZraS噬菌体对铅离子的底物特异性，获得突变样品；对突变样品进行氨基酸测序分析，获得突变位点信息；根据突变位点信息构建所述膜蛋白ZraS突变体的表达载体，记作pZraS，并表达获得所述膜蛋白ZraS突变体。
[0019]进一步地，所述制备方法具体包括：
[0020]1.PACE定向进化辅助质粒的构建
[0021]1.1正筛辅助质粒及宿主的构建
[0022]1.11 gIII蛋白表达质粒AP1的构建：gIII蛋白由启动子psp启动，将启动子 psp下游插入ZraR调控蛋白的识别位点核酸序列，获得AP1质粒；
[0023]1.12调控蛋白ZraR及诱变基因表达质粒MP
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ZraR的构建：载体模板为诱变质粒MP4，于诱变质粒MP4阿拉伯糖启动子上游插入ZraR基因序列，启动子为J23109，获得MP
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ZraR质粒；
[0024]1.13 AP1、MP
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ZraR质粒共转化E.coli S1030感受态细胞，获得正筛宿主，记作Host positive；
[0025]1.2负筛辅助质粒及宿主的构建
[0026]1.21 gIII蛋白表达质粒AP2的构建：gIII蛋白由启动子J23109启动，将启动子J23109下游插入ZraR调控蛋白的识别位点核酸序列，获得AP2质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌双组分调控系统膜蛋白ZraS突变体，其特征在于：所述突变体包括S154T、A214S、Q313R、T415A中的一种或几种；其中，大肠杆菌膜蛋白ZraS的第154位氨基酸S突变为T得到突变体S154T；大肠杆菌膜蛋白ZraS的第214位氨基酸A突变为S得到突变体A214S；大肠杆菌膜蛋白ZraS的第313位氨基酸Q突变为R得到突变体Q313R；大肠杆菌膜蛋白ZraS的第415位氨基酸T突变为A得到突变体T415A。2.编码权利要求1所述的大肠杆菌双组分调控系统膜蛋白ZraS突变体的基因。3.包含权利要求2所述的基因的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体中ZraS基因的启动子为内源性启动子ZraSp。5.包含权利要求2所述的基因的重组质粒。6.包含权利要求5所述的重组质粒的重组细胞。7.权利要求1所述的大肠杆菌双组分调控系统膜蛋白ZraS突变体的制备方法，其特征在于：包括：构建SP
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ZraS噬菌体；采用噬菌体辅助连续定向进化方法(PACE)通过正筛与负筛交替进化SP
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ZraS噬菌体对铅离子的底物特异性，获得进化样品；对进化样品进行氨基酸测序分析，获得突变位点信息；根据突变位点信息构建所述膜蛋白ZraS突变体的表达载体，记作pZraS，并表达获得所述膜蛋白ZraS突变体。8.根据权利要求7所述的大肠杆菌双组分调控系统膜蛋白ZraS突变体的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体包括：1.PACE定向进化辅助质粒的构建1.1正筛辅助质粒及宿主的构建1.11gIII蛋白表达质粒AP1的构建：gIII蛋白由启动子psp启动，将启动子psp下游插入ZraR调控蛋白的识别位点核酸序列，获得AP1质粒；1.12调控蛋白ZraR及诱变基因表达质粒MP
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ZraR的构建：载体模板为诱变质粒MP4，于诱变质粒MP4阿拉伯糖启动子上游插入ZraR基因序列，启动子为J23109，获得MP
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ZraR质粒；1.13AP1、MP
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ZraR质粒共转化E.coli S1030感受态细胞，获得正筛宿主，记作Host positive；1.2负筛辅助质粒及宿主的构建1.21gIII蛋白表达质粒AP2的构建：gIII蛋白由启动子J23109启动，将启动子J23109下游插入ZraR调控蛋白的识别位点核酸序列，获得AP2质粒；1.22gIIIneg蛋白表达质粒AP3的构建：gIIIneg蛋白由启动子psp启动，启动子下游插入ZraR调控蛋白的识别位点核酸序列，获得AP3质粒；1.23AP2、AP3、MP
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ZraR质粒共转化E.coli S1030感受态细胞，获得负筛宿主，记作Host negative；1.3噬菌体SP
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ZraS的构建1.31以M13噬菌体基因组为模板，扩增除gIII外的大片段；以E.coli S1030基因组...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘复荣，张润钊，崔金明，李小明，
申请(专利权)人：广州先进技术研究所，
类型：发明
国别省市：