半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L-半胱氨酸中的应用制造技术

本发明专利技术综合利用随机突变、饱和突变和组合突变方法，得到了多种L

【技术实现步骤摘要】
半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产L
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半胱氨酸中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及外排能力增强的L
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半胱氨酸转运蛋白突变体及其在制备L
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半胱氨酸中的应用。

技术介绍

[0002]L
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半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，在食品、医药、化妆品及饲料工业等领域都具有广泛的应用，其中食品添加剂用途约占半胱氨酸产量的近六成。近年来，研究人员开发出许多半胱氨酸新产品，如面包发酵改良剂、半胱氨酸口服片、乙酰半胱氨酸滴眼液、保健口香糖等。随着半胱氨酸终端用途的不断开拓，全球半胱氨酸市场需求迅速增大，市场前景十分光明。我国半胱氨酸产量约占全球总产量的2/3，每年出口量保持在80%以上，在竞争激烈的国际市场上占据着重要地位。
[0003]目前，大多数L
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半胱氨酸是通过工业水解人类毛发和家禽羽毛获得的，但往往伴随着产量低以及严重环境和安全问题。近年来，微生物发酵生产L
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半胱氨酸受到越来越多的关注，与目前的蛋白水解制备法相比，微生物发酵法提供了一种食品安全、经济效益高、环境友好的替代生产策略。系统代谢工程和合成生物学的发展为改造微生物菌株以高效生产生物基化学品提供了各种工具和技术。在这些策略中，通过改造优化底物、代谢中间体或代谢产物的转运能力，为菌株增强底物吸收、克服代谢抑制和保护细胞免受有毒化合物的毒害提供了很好的机会，是提高微生物细胞工厂鲁棒性和生产效率的有效方法。但不幸的是，大多数天然转运蛋白具有一些固有的局限性，例如底物转运活性低、底物亲和力差以及未预料的底物/产物抑制效应等，阻碍了这些转运蛋白在工业生物技术中的广泛应用。
[0004]由于高浓度L
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半胱氨酸具有细胞毒性及复杂的反馈效应，用于工业发酵生产L
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半胱氨酸的高效微生物细胞工厂的构建具有较大挑战性。为了减轻其细胞毒性，微生物已经进化出多种策略来维持细胞内L
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半胱氨酸的低水平，例如通过降解与外排两种途径降低胞内L
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半胱氨酸浓度。因此，提升L
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半胱氨酸外排系统对于微生物发酵生产L
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半胱氨酸是必需的。目前在大肠杆菌中，已证实有几种转运蛋白与L
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半胱氨酸的输出密切相关，其中包括内膜转运蛋白EamB（YfiK）、Eama（YdeD）、Bcr、CydDC和TolC。作为主要的L
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半胱氨酸外排蛋白，EamB的过表达可促进大肠杆菌细胞中O
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乙酰丝氨酸和L
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半胱氨酸的分泌过程，在改善工程菌株发酵生产L
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半胱氨酸中具有重要意义。然而，目前关于EamB转运蛋白的结构和转运机制的研究匮乏，增加了通过设计改造提高其转运效率的难度。

技术实现思路

[0005]基于上述要求，本专利技术的首要目的在于提供L
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半胱氨酸转运蛋白突变体，以使得其底物转运能力得到提升，利于微生物发酵生产L
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半胱氨酸等代谢产物。
[0006]本专利技术提供一种来源于Escherichia coli MG1655的L
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半胱氨酸转运蛋白EamB突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丙氨酸A或丝氨酸S，第157位由天冬酰胺N突变为
甲硫氨酸M或丝氨酸S中的一个或多个位点突变。
[0007]优选实施方式是，仅第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丙氨酸A，第157位由天冬酰胺N突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S，第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S中的一个位点突变；仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M和第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S的组合突变；仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变；仅存在第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变；仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变。
[0008]其中更优选地，仅存在第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变，最优选的其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0009]本专利技术进一步提供所述L
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半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的编码基因。
[0010]优选地实施方式中，所述L
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半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的编码基因的核苷酸序列是在SEQ ID No.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。在更优选地实施方式中，所述的L
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半胱氨酸转运蛋白EamB突变体的编码基因核苷酸序列如选为SEQ ID No.4（编码I83M
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G156S）、SEQ ID No.5（编码I83M
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N157S）、SEQ ID No.6（编码G156S
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N157S）以及SEQ ID No.7（编码I83M
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G156S
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N157S）所示。
[0011]本专利技术还提供含有所述的L
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半胱氨酸转运蛋白EamB突变体编码基因的表达载体和宿主细胞。
[0012]本专利技术还提供所述的L
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半胱氨酸转运蛋白EamB突变体或其编码基因或者所述的重组宿主细胞在制备L
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半胱氨酸中的应用。
[0013]在具体实施方式中，培养导入含有所述的L
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半胱氨酸转运蛋白EamB突变体编码基因的表达载体的微生物细胞以产生L
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半胱氨酸，进一步还包括收集和纯化L
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半胱氨酸的步骤。
[0014]在一个更具体实施方式中，所述表达载体是低拷贝质粒pMW118，通过构建含有EamB突变体编码基因的重组质粒，并将其导入微生物细胞中，用于发酵生产L
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半胱氨酸等代谢产物。在更优选的实施方式中，所述微生物细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
[0015]本专利技术进一步提供增强L
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半胱氨酸生产能力的重组菌，其特征在于，其出发菌株中过表达所述的编码基因。优选地，所述出发菌株中敲除了L
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半胱氨酸降解途径基因tanA和yhaM，同时过表达L
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半胱氨酸合成途径基因cysE。在具体实施方式中，其出发菌株是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、菠萝泛菌、枯草芽孢杆菌，优选地为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌。
[0016]本专利技术通过以下技术思路实现，以大肠杆菌E. coli MG1655基因组为模板，利用易错PCR随机突变方法获得Eam本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于Escherichia coli MG1655的L
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半胱氨酸转运蛋白EamB突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丙氨酸A，第157位由天冬酰胺N突变为甲硫氨酸M，第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S中的一个或多个位点突变。2.如权利要求1所述的EamB突变体，其特征在于，仅第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丙氨酸A，第157位由天冬酰胺N突变为甲硫氨酸M，第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S中的一个位点突变；或者仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M和第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S的组合突变；或者仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变；或者仅存在第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变；或者仅存在第83位由异亮氨酸I突变为甲硫氨酸M，第156位由甘氨酸G突变为丝氨酸S和第157位由天冬酰胺N突变为丝氨酸S的组合突变。3.如权利要求1所述的EamB突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。4.如权利要求1至3任一项所述的EamB突变体的编码基因。5.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘君，刘光辉，徐宁，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：