一种大肠杆菌K99株精制卵黄抗体及其制备方法技术

一种大肠杆菌K99株精制卵黄抗体及其制备方法。本发明专利技术涉及大肠杆菌K99株纤毛抗原的提纯、降低内毒素的方法及大肠杆菌K99株精制卵黄抗体的制备方法，大肠杆菌K99株精制卵黄抗体对犊牛腹泻治疗的给药剂量和给药方法。体对犊牛腹泻治疗的给药剂量和给药方法。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌K99株精制卵黄抗体及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及大肠杆菌K99株低毒素纤毛抗原的制备方法及大肠杆菌K99株精制卵黄抗体的制备方法，尤其涉及大肠杆菌K99株精制卵黄抗体犊牛腹泻的给药剂量和给药方法。

技术介绍

[0002]大肠杆菌(Escherichia coli)有多种存在形式。一类是寄生于动物肠道的正常细菌，与机体共生共存，另一类是表现出一定的病原性而引起各种疾病的致病性大肠杆菌。致病性的大肠杆菌一般导致动物腹泻，严重感染时会出现败血症，特别是对幼龄动物的危害较大。在规模化的奶牛或肉牛养殖场，犊牛大肠杆菌病是一种常发的细菌性传染病，犊牛发病后主要出现腹泻、消瘦等症状，如果发生严重败血症，会出现较高的死亡率。
[0003]致病性大肠杆菌通过感染动物体，在肠道内释放肠毒素引起犊牛腹泻，产生肠毒素的大肠杆菌，按纤毛血清类型可分为K88、K99、987P及F18。致病性大肠杆菌通过菌体表面密集的纤毛突破动物体的天然免疫屏障后进入肠道，与肠粘膜上皮细胞的纤毛受体结合，感染宿主。大肠杆菌感染后产生抵抗肠道蠕动及内容物的清洗，利用机体的营养物质进行繁殖，并释放肠毒素，引起细胞内水和电解质平衡失调，从而产生水样腹泻。由此可以看出纤毛是致病过程的重要感染媒介，也是传统疫苗研究中的重要菌体抗原部分。纤毛抗原具有良好的免疫原性，免疫机体后能产生相应的纤毛抗体，对产肠毒素致病性大肠杆菌具有很好的免疫保护作用。
[0004]致病性大肠杆菌血清型较多，给本病的预防带来困难，一般选择抗生素治疗，由于抗生素在治疗过程中容易发生耐药性，或者造成犊牛肠道有益菌群的生态紊乱加重腹泻的发生。在当前抗生素使用受到严格限制的条件下，犊牛大肠杆菌病的预防和治疗需要找寻抗生素的替代途径。例如中国专利CN101450206A和CN103509838通过制备大肠埃希氏菌K88、K99和987P纤毛亚单位疫苗，用于预防仔猪黄痢。中国专利CN104017060A提供了一种大肠杆菌菌毛抗原的提取方法，从而用于制备卵黄抗体，为相关疾病的预防和治疗提供思路。其中口服卵黄抗体是一种主要发展趋势，目前在家禽、仔猪大肠杆菌引起的腹泻治疗上已经有很好的应用。原来在家禽和家畜大肠杆菌病发病明显，随着养殖规模的逐渐增加和规模化，密集圈养仍占主导地位，大肠杆菌引起的犊牛腹泻逐年增加，对犊牛腹泻的防控需要开展针对性的防控，大肠杆菌的卵黄抗体是否可以应用在犊牛腹泻的治疗中，目前有不少探讨，但都没能产业化，治疗效果没有家禽和其它家畜的效果明显。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对大肠杆菌K99株提供了高效价精制卵黄抗体的制备方法，进一步提供了治疗大肠杆菌引起的犊牛腹泻给药剂量和治疗使用方法，取得了可喜的可产业化的临床疗效和制剂的稳定效价。
[0006]首先，本专利技术提供一种大肠杆菌K99株低毒素纤毛抗原的制备方法。
[0007]在制备纤毛抗原的过程中，破裂菌体、提取纤毛、降低菌体释放的内毒素是纤毛抗原制备的关键因素。
[0008]为解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]大肠杆菌K99株低毒素含量纤毛抗原的制备方法：(1)利用改良Minca培养基培养后经热裂解法获得初提取纤毛抗原，(2)利用曲拉通和离心的方式多次处理去除内毒素，内毒素含量不高于1000EU/ml(鲎试剂检测方法)，纤毛抗原的效价保持在1:1280及以上，获得纤毛抗原。
[0010]曲拉通的用量在0.5％
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2.5％，优选使用量为1.0％
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1.5％。离心转速优选8000rpm
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20000rpm，进一步优选8000rpm
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15000rpm，更进一步优选8000rpm
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10000rpm离心时间20
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60分钟，优选20
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30分钟。处理次数不高于4次，如处理次数高于4次，处理后大分子蛋白会遭到破坏，导致抗原的分子结构失活，效价降低。
[0011]进一步，本专利技术提供一种大肠杆菌K99株纤毛抗原免疫原接种的方法：(1)、将纤毛抗原灭活，添加白油佐剂，制备为免疫原；(2)将免疫原接种200～240日龄高产期商品蛋鸡，首次免疫后28～30日进行二次免疫，(3)二次免疫后14～21日进行大肠杆菌K99株纤毛抗原(未含佐剂)的加强免疫，(4)在加强免疫后10～14日开始采集鸡蛋进行卵黄抗体的制备。
[0012]在本专利技术的免疫接种方案中，加强免疫的免疫原由油佐剂的免疫原变成纤毛抗原溶液，可以由降低免疫佐剂起到的免疫刺激反应，增强了机体对免疫原进行免疫记忆的应答反应。
[0013]更进一步，本专利技术提供一种大肠杆菌K99株精制卵黄抗体的制备方法：
[0014](1)收集卵黄，按照卵黄体积的6～10倍加入醋酸盐缓冲液，酸化处理；
[0015](2)酸化处理的卵黄混合液进行离心处理，收集上清液，加入正辛酸去脂处理过夜；
[0016](3)收集去脂过夜处理的卵黄混合液下层澄清液，浓缩后滤膜过滤除菌。
[0017](4)按照1:1比例加入佐剂，如20％的脱脂乳，冻干，获得大肠杆菌K99株卵黄抗体。该抗体效价1:256。
[0018]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0019]本专利技术提供的大肠杆菌K99株纤毛抗原，内毒素含量在1000EU/ml及以下，利用该纤毛抗原制备的免疫原接种高产期商品蛋鸡后不影响产蛋率。为后续多次免疫接种商品蛋鸡提供了合格的免疫原。
[0020]本专利技术提供的大肠杆菌K99株卵黄抗体治疗大肠杆菌引起的犊牛腹泻的给药剂量和给药方法。
[0021]精制卵黄抗体的治疗效果与抗生素相当，并且改注射途径为更方便操作的饲喂途径，且使用剂量低(剂量为大肠杆菌K99卵黄抗体效价1:64，经口途径喷雾饲喂，连续使用3日)；并且与现有大肠杆菌混合毒株制备的卵黄抗体相比有明显的治愈优势。可能与引起犊牛腹泻的毒株相关性越强，治疗效果越好，混合毒株的使用反而降低了治疗的针对性。
具体实施方式
[0022]通过以下示例来进一步说明本专利技术。
[0023]实施例1大肠杆菌K99纤毛抗原的制备方法
[0024]1.1大肠杆菌K99株一级种子繁殖及鉴定：将保存的冻干菌种，分别划线接种改良Minca琼脂平板，37℃培养24h，选取光滑圆整单个菌落若干个，分别用K99因子血清做平板凝集反应，每个菌株选取10个凝集反应“++++”的菌落，接种改良Minca液体培养基，37℃振荡培养24h，分别取样进行纯粹检验，并用相应的纤毛抗原单因子血清作平板凝集反应。纯粹检验合格后按照10％加入甘油混匀，分装于灭菌小管中，作为一级种子。
[0025]1.2大肠杆菌K99株二级种子繁殖及鉴定：取大场杆菌一级种子，接种改良Minca琼脂平板，37℃培养24h，选取光滑圆整单个菌落若干个，分别用K99因子血清做平板凝集反应，每个菌株选取10个凝集本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌K99株低毒素纤毛抗原的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)利用改良Minca培养基培养后经热裂解法获得初提取纤毛抗原，(2)利用曲拉通和离心的方式多次处理去除步骤(1)纤毛抗原的内毒素，内毒素含量不高于1000EU/ml(鲎试剂检测方法)，纤毛抗原的效价保持在1:1280及以上，获得纤毛抗原。2.如权利要求1所述的大肠杆菌K99株低毒素纤毛抗原的制备方法，曲拉通和离心的方式处理4次。3.如权利要求1或2所述的大肠杆菌K99株低毒素纤毛抗原的制备方法，曲拉通的用量在0.5％
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2.5％。4.一种大肠杆菌K99株纤毛抗原免疫原接种的方法，所述方法包括如下步骤：(1)、将纤毛抗原灭活，添加白油佐剂，制备为免疫原；(2)将免疫原接种200～240日龄高产期商品蛋鸡，首次免疫后28～30日进行二次免疫，(3)二次免疫后14～21日进行大肠杆菌K99株纤毛抗原的加强免疫，(...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚川川，吴峰，赵卓，胡义彬，郭小燕，张爽，张贵新，李晓亮，石凯亓，张纪飞，江厚生，王力，
申请(专利权)人：华夏兴洋江苏生物科技有限公司北京生泰尔科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：