一种规模化生产套索肽21的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种规模化生产套索肽21的方法，包括以下步骤：S1、菌株活化；S2、制备摇瓶种子；S3、种子罐培养；S4、发酵罐培养；S5

【技术实现步骤摘要】
一种规模化生产套索肽21的方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种规模化生产套索肽21的方法。

技术介绍

[0002]套索肽(Lassopeptide)是一类具有生物活性的核糖体肽天然产物，因其独特的套索结构而得名，一般由15
‑
26个氨基酸残基组成，分子量在1500
‑
2500Da之间。套索肽的N端一般为甘氨酸，其氨基可与第八或第九位的谷氨酸或者天冬氨酸的侧链羧基形成酰胺环，而其C末端尾部穿过环，从而形成稳定的拓扑结构，这一低熵的“套索”构型赋予了套索肽具有强的耐热性和抗蛋白酶水解活性。根据二硫键存在与否以及二硫键的数量将套索肽分为四大类，其中I类套索肽来源于链霉菌，II类套索肽有源于革兰氏阴性菌，III类来源于链霉菌，Ⅳ类套索肽的二硫键连接C端尾上。根据基因组序列，绝大多数套索肽属于II类。
[0003]II类套索肽中，Microcin J25(Mcc J25)是套索肽的典型结构研究模型，不仅是最早发现的套索肽之一，且是最早鉴定出其生物合成基因簇的肽。Mcc J25是由21残基质粒编码，具体由一个8残基循环和一13残基尾部组成，尾部循环返回并穿过循环。可抑制革兰氏阴性细菌RNA聚合酶(RNAP) 的活性，以及抑制革兰氏阴性细菌(主要或仅革兰氏阴性肠溶药物)的生长。
[0004]Mcc J25可能是农业，动物生产和食品业消减和预防大肠杆菌和沙门氏菌的有效办法，文献报道：日粮添加Mcc J25可提高断奶仔猪和肉鸡的生长性能，减缓腹泻和系统性炎症的发生，提高肠道屏障功能，改善粪便微生态组成。通过在小鼠模型中添加Mcc J25的研究中，发现中剂量添加有正向的效果，高剂量添加有毒性风险。
[0005]套索肽主要通过基因工程和化学合成两种方法合成，其中基因工程合成主要通过异源表达套索肽，但是目前存在表达量低的技术问题。为了解决该问题，本申请人申请的公开号为CN113774006A 的中国专利技术专利申请，公开了一种高效表达Mcc J25的工程菌株，构建时：分别对mcjABCD进行基因操作，成为一个方向，而且在大肠杆菌中共用一个启动子T7，克隆在载体pBR322，实现了在大肠杆菌的高效表达，表达量为2.4g/L。该专利构建了大肠杆菌表达载体和植物乳杆菌表达载体，实现了 Mcc J25的高效表达。在大肠杆菌进行胞外表达和植物乳杆菌进行胞内表达，表达量分别达到为4.1g/L 和2.3g/L，为下一步生物兽药和饲料添加剂的应用奠定了基础。
[0006]上述专利提供的Mcc J25的生产方法目前主要限于少量获得Mcc J25，用于实验室研究，还无法进行在产业上规模化生产。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种规模化生产套索肽21的方法，以至少解决上述技术问题之一。
[0008]本专利技术目的之一在于提供一种规模化生产套索肽21的方法，包括以下步骤：
[0009]S1、菌株活化：取重组大肠杆菌于培养基中活化，得到活化的重组大肠杆菌；
[0010]S2、采用摇瓶培养基培养活化的重组大肠杆菌制备摇瓶种子；
[0011]摇瓶培养基包括以下重量份原料：酵母提取物0.5
‑
1.5份、酵母浸膏1
‑
3份、甘油0.5
‑
1.5份、蛋白胨0.5
‑
1.5份、氯化钠0.3
‑
0.6份、磷酸二氢钾0.3
‑
0.6份、磷酸氢二钾0.2
‑
0.5份、硫酸镁0.1
‑
0.3份、硫酸铵4
‑
6份；
[0012]S3、将S2得到的重组大肠杆菌接入种子罐培养基进行培养；种子罐培养基包括以下重量份原料：酵母提取物5
‑
10份、玉米浆膏10
‑
20份、蛋白胨5
‑
10份、氯化钠3
‑
8份、磷酸二氢钾3
‑
8份、磷酸氢二钾3
‑
8份、硫酸镁1
‑
3份、硫酸铵5
‑
20份、淀粉20
‑
30份；
[0013]S4、将S3得到的重组大肠杆菌接入发酵培养基进行发酵，得到发酵液；发酵培养基包括以下重量份原料：酵母提取物20
‑
40份、玉米浆膏10
‑
15份、硫酸铵30
‑
50份、玉米浆粉10
‑
20份、氯化钠 10
‑
20份、磷酸二氢钾10
‑
30份、磷酸氢二钾10
‑
30份、尿素20
‑
30份、蔗糖40
‑
60份；
[0014]S5
‑
S8、将S4得到的发酵液过滤、浓缩和干燥后，得到套索肽。
[0015]优选地，S1的活化条件为32
‑
36℃下活化12
‑
16h。
[0016]优选地，S2的培养条件为：在32℃
‑
36℃培养12
‑
16h。
[0017]优选地，S3的培养条件为：32
‑
36℃；0.01
‑
0.1Mpa；通气比0.5
‑
1；4
‑
8h后pH反弹至7.2
‑
7.5。
[0018]优选地，S4的培养条件为：32
‑
36℃；压力0.01
‑
0.1Mpa；通气比0.5
‑
1；搅拌转速400
‑
800r/min，溶氧维持在20
‑
30％，流加质量百分比浓度为40
‑
60％，葡萄糖溶液维持残糖在0.8
‑
1.6％，流加氢氧化钠维持pH＝6.8
‑
7.4。
[0019]优选地，S5中，添加助滤剂、絮凝剂进行固液分离，收集板框滤液。
[0020]优选地，S5中，助滤剂为硅藻土10
‑
50份；絮凝剂为聚合氯化铝0.1
‑
0.5份和聚丙烯酰胺0.1
‑
0.5 份。
[0021]优选地，将S5得到的板框滤液采用超滤膜截留3000Da以下的截留液，再通过纳滤膜截留 1000
‑
3000Da的分子量，得到截留液。
[0022]优选地，S7中，将S6得到的截留液经三效浓缩，一效温度为70
‑
80℃，二效温度为60
‑
70℃，三效温度为50
‑
60℃，压力为
‑
0.2至
‑
0.8Mpa，得到三效浓缩液。
[0023]优选地，S8中，将S7得到的三效浓缩液进行喷雾干燥，得到套索肽。
[0024]本专利技术的原理和有益效果在于：
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种规模化生产套索肽21的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、菌株活化：取重组大肠杆菌于培养基中活化，得到活化的重组大肠杆菌；S2、采用摇瓶培养基培养活化的重组大肠杆菌制备摇瓶种子；摇瓶培养基包括以下重量份原料：酵母提取物0.5
‑
1.5份、酵母浸膏1
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3份、甘油0.5
‑
1.5份、蛋白胨0.5
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1.5份、氯化钠0.3
‑
0.6份、磷酸二氢钾0.3
‑
0.6份、磷酸氢二钾0.2
‑
0.5份、硫酸镁0.1
‑
0.3份、硫酸铵4
‑
6份；S3、将S2得到的重组大肠杆菌接入种子罐培养基进行培养；种子罐培养基包括以下重量份原料：酵母提取物5
‑
10份、玉米浆膏10
‑
20份、蛋白胨5
‑
10份、氯化钠3
‑
8份、磷酸二氢钾3
‑
8份、磷酸氢二钾3
‑
8份、硫酸镁1
‑
3份、硫酸铵5
‑
20份、淀粉20
‑
30份；S4、将S3得到的重组大肠杆菌接入发酵培养基进行发酵，得到发酵液；发酵培养基包括以下重量份原料：酵母提取物20
‑
40份、玉米浆膏10
‑
15份、硫酸铵30
‑
50份、玉米浆粉10
‑
20份、氯化钠10
‑
20份、磷酸二氢钾10
‑
30份、磷酸氢二钾10
‑
30份、尿素20
‑
30份、蔗糖40
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60份；S5
‑
S8、将S4得到的发酵液过滤、浓缩和干燥后，得到套索肽。2.根据权利要求1所述的一种规模化生产套索肽21的方法，其特征在于，S1的活化条件为32
‑
36℃下活化12
‑
16h。3.根据权利要求1或2所述的一种规模化生产套索肽21的方法，其特征在于，S2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏晓春，庞义文，杨贤彬，赵珊，高伟峰，
申请(专利权)人：安杰利重庆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：