一种GP32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种GP32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域，本发明专利技术构建了一种GP32蛋白突变体，相对于其他GP32蛋白而言，该突变体结合单链DNA的效率更高，可更有效地促进限制性内切酶的水解效果、提高RT

【技术实现步骤摘要】
一种GP32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体而言，涉及一种GP32蛋白突变体、重组载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]单链结合蛋白(SSB，single strand DNA
‑
binding protein)：又称DNA结合蛋白，是DNA复制所必须的。单链结合蛋白不属于酶，大肠杆菌细胞中的单链结合蛋白由4个相同的亚基组成，相对分子质量为74000，结合单链DNA的跨度约32个核苷酸单位；DNA解旋后，DNA分子只要碱基配对，就有结合成双链的趋向。SSB结合于螺旋酶沿复制叉方向向前推进产生的单链区，防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解的蛋白质。ssb作用时表现协同效应，保证SSB在下游区段的继续结合。它不像聚合酶那样沿着复制方向向前移动，而是不停的结合，脱离。在实际应用中，gp32单链结合蛋白提升限制性内切酶的水解效果、增强T4DNA聚合酶的活性和提高PCR的产量、提高RT
‑
PCR中反转录的效率。来自大肠杆菌的单链结合蛋白已用于体外RNA/单链结合蛋白(SSB)复合物形成试验以及蛋白质纯化，用于测定整合子attC位点的完整性和功能性。对单链DNA的高特异性结合。可用于提高PCR的特异性，启动有问题的DNA模板测序。
[0003]随着RPA技术的推广，目前T4GP32在使用中的结合效率成为了关注点，现有的GP32单链结合蛋白虽然具备结合活性，但是结合效率不高，且工业化生产中GP32单链结合蛋白单位菌体的表达量较低，纯度不够高，这也使得其在RPA中的使用效果相对较差。
[0004]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种GP32蛋白突变体及其应用。
[0006]本专利技术是这样实现的：
[0007]第一方面，本专利技术实施例提供了一种GP32蛋白突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]第二方面，本专利技术实施例提供了一种分离的核酸，其包括编码如前述实施例所述的GP32蛋白突变体的核酸序列。
[0009]第三方面，本专利技术实施例提供了一种重组载体，其含有如前述实施例所述的分离的核酸。
[0010]第四方面，本专利技术实施例提供了一种重组载体的构建方法，其包括：将所述分离的核酸或其表达盒插入载体中构建获得。
[0011]第五方面，本专利技术实施例提供了一种基因工程菌，其含有如前述实施例所述的重组载体。
[0012]第六方面，本专利技术实施例提供了如前述实施例所述的GP32蛋白突变体的制备方法，其包括培养如前述实施例所述的基因工程菌，以诱导表达GP32蛋白突变体。
[0013]第七方面，本专利技术实施例提供了如前述实施例所述的GP32蛋白突变体在核酸扩增中的应用，所述核酸扩增不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
[0014]本专利技术具有以下有益效果：
[0015]本专利技术构建了一种GP32蛋白突变体，相对于其他GP32蛋白而言，该突变体结合单链DNA的效率更高，可更有效地促进限制性内切酶的水解效果、提高RT
‑
PCR中反转录的效率、增强T4 DNA聚合酶的活性以及提高PCR的产量，在RPA中应用效率极佳。
[0016]此外，本专利技术还提供了GP32蛋白突变体的表达载体的构建以及蛋白的纯化，克服了现有工业化生产中GP32蛋白菌体表达量较低、纯度不高的技术问题，实现了表达载体在宿主细胞中的高表达，提高了GP32蛋白的得率，为GP32蛋白的研究、应用提供了途径。
附图说明
[0017]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0018]图1为GP32单链结合功能的区域第27～241位氨基酸对应的三维结构；
[0019]图2为GP32蛋白突变体的纯化质控结果；
[0020]图3为GP32蛋白突变体在普通PCR中的应用效果；
[0021]图4为GP32蛋白突变体在qPCR中的应用效果。
具体实施方式
[0022]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0023]本专利技术实施例提供了一种GP32蛋白突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
[0024]MFKRKSTADLAAQMAKLNGNKGFSSEDKGEWKLKLDASGNGQAVIRFLPAKTDDALPFAILVNHGFKKNGKWYIETCSSTHGDYDSCPVCQYISKNDLYNTNNEGKVFKYRFGKKIWDKINAMIAVDTEMGETPVDVTCPWEGANFVLKVKQVSGFSNYDESKFLNQSAIPNIDDESFQKELFEQMVDLSEMTSKDKFKSFEELNTKFNQVLGTAALGGAAAAAASVADKVASDLDDFDKDMEAFS。
[0025]野生型的氨基酸序列为：MFKRKSTADLAAQMAKLNGNKGFSSEDKGEWKLKLDASGNGQAVIRFLPAKTDDALPFAILVNHGFKKNGKWYIETCSSTHGDYDSCPVCQYISKNDLYNTNNEGKVFKYRFGKKIWDKINAMIAVDTEMGETPVDVTCPWEGANFVLKVKQVSGFSNYDESKFLNQSAIPNIDDESFQKELFEQMVDLSEMTSKDKFKSFEELNTKFNQVLGTAALGGAAAAAASVADKVASDLDDFDKDMEAFSSAKTEDDFMSSSSSDDGDLDDLLAGL。
[0026]本专利技术通过一系列创造性劳动，分析对比了不同来源的GP32结构上的差异性，结合蛋白的三维结构分析，进行了GP32原始序列C端氨基酸序列(247～272)段的敲除，从而获得了有着高效ssDNA结合效率的GP32蛋白突变体。该突变体的单链结合功能区域为27～241段，三维结构见图1。
[0027]本专利技术实施例还提供了一种分离的核酸，其包括编码如前述实施例所述的GP32蛋白突变体的核酸序列。
[0028]优选地，其序列如SEQ ID No.2所示(5
’‑3’
)：
[0029]atgtttaaacgtaagtctactgctgatttagccgcacaaatggcgaaattgaatggtaacaagggcttctcctcagaagacaaaggagagtggaagcttaaactcgatgcttcggggaatggt本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GP32蛋白突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种分离的核酸，其特征在于，其包括编码如权利要求1所述的GP32蛋白突变体的核酸序列。3.根据权利要求2所述的分离的核酸，其特征在于，其序列如SEQ ID No.2所示。4.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求2或3所述的分离的核酸。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pET系列为框架基础构建获得的；优选地，所述pET系列包括pET22
‑
b质粒和pET32
‑
a质粒中的任意一种。6.如权利要求4或5所述的重组载体的构建方法，其特征在于，其包括：将所述分离的核酸或其表达盒插入载体中构建获得。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，将所述分离的核酸或其表达盒插入载体的步骤包括：对所述载体进行线性化处理，获得线性化载体；将线性化载体与所述分离的核酸或其表达盒进行重组，获得重组载体；优选地，将线性化载体与所述分离的核酸进行重组的步骤包括：采用引物对，以如权利要求1所述的GP32蛋白突变体基因为模板进行扩增；将线性化载体与扩增后的产物混合重组，获得重组载体；优选地，所述引物对的上游引物和下游引物的序列依次如SEQ ID No.3～4所示；优选地，所述载体选自质粒、噬菌体和病毒载体中的任意一种；优选地，所述质粒为pET22
‑
b质粒，所述线性化载体为将pET22
‑
b质粒进行XhoI和XbaI双酶切后的产物。8.一种基因工程菌，其特征在于，其含有如权利要求4或5所述的重组载体。9.如权利要求1所述的GP32蛋白突变体的制备方法，其特征在于，其包括培养如权利要求8所述的基因工程菌，以诱导表达GP32蛋白突变体；优选地...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁含文，
申请(专利权)人：南京巨匠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：