重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体、制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是涉及重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体、制备方法及应用。本发明专利技术提供的重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体，通过对野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶进行点突变分子改造，从而使得该酶热稳定性提高，同时还提高了本产品的反转录效率和对长片段cDNA的反转录能力。此外，本发明专利技术还提供了能够表达上述突变体的重组表达载体，该重组表达载体转化进大肠杆菌后，能够高效表达上述突变体。体。体。

【技术实现步骤摘要】
重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]反转录酶(Reverse transcriptase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶。逆转录酶(M
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MLV)从Moloney Murine LeukemiaVirus分离出来，这个酶已经作了遗传性上的改变，即除去了与它联在一起的核糖核酸酶H活性(一种专门切割DNA与RNA杂交链上RNA分子的酶)，这个酶应用于cDNA的第一链合成和引物的延伸。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以mRNA为模板时，先合成单链DNA(ssDNA)，再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下，以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA(dsDNA)，再由核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。
[0003]因此，反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝，然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。目前M
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MLV逆转录酶可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。该酶是通过点突变使RNaseH活性缺失，具有的DNA聚合酶的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有显著提高。
[0004]但是，目前缺失RNaseH活性的野生型的逆转录酶仍存在一定的缺陷，主要表现为对于大片段的cDNA反转录能力差，并且热稳定性较差。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于，提供一种新型重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体，以期该突变体能够解决现有技术中，逆转录酶M
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MLV对大片段的cDNA反转录能力，以及热稳定性差的技术问题。
[0007]本专利技术的另一个目的在于，提供能够编码上述突变体的生物材料，以及应用所述生物材料制备上述突变体的方法，使得能够批量化生产纯度和活性达到市场要求的上述突变体产品。
[0008]本专利技术还有一个目的在于，将上述得到的突变体产品应用于新冠病毒SARS
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CoV
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2的反向PCR或者制备用于反向PCR新冠病毒SARS
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CoV
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2的产品，从而为新冠病毒SARS
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CoV
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2的药物开发、药物筛选以及科学研究提供充足的技术支持。
[0009]为了解决上述技术问题，实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体，所述突变体是野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶经过至少一个氨基酸残基的替换获得的，所述野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。
[0011]在可选的实施方式中，所述突变体具有如SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。
[0012]第二方面，本专利技术提供生物材料，包括以下任一项：
[0013](
ⅰ
)编码前述实施方式任一项所述突变体的核酸分子；
[0014](
ⅱ
)含有(
ⅰ
)所述核酸分子的重组载体，所述重组载体的原始载体为pET22b；
[0015](
ⅲ
)含有(
ⅰ
)所述核酸分子或(
ⅱ
)所述重组载体的转化体，所述转化体宿主选自大肠杆菌。
[0016]在可选的实施方式中，所述大肠杆菌选自E.coli Rosetta或E.coli BL21。
[0017]第三方面，本专利技术提供前述实施方式任一项所述突变体的制备方法，所述制备方法包括构建野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体，扩增得到线性重组表达载体DNA，线性重组表达载体DNA经定点突变后，使用同源重组酶进行环化得到突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体，将突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体转化进宿主细菌，发酵培养后，破碎菌体，收集突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶。
[0018]在可选的实施方式中，使用两组引物对进行两个定点突变，其中第一引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；第二引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0019]在可选的实施方式中，所述扩增使用的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0020]在可选的实施方式中，所述重组表达载体的原始载体为pET22b。
[0021]在可选实施方式中，所述同源重组酶为UvsXase，所述宿主细菌选自E.coli Rosetta或E.coli BL21。
[0022]第四方面，本专利技术提供前述实施方式任一项所述突变体在SARS
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CoV
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2病毒qPCR，或制备SARS
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CoV
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2病毒qPCR产品中的应用。
[0023]在可选实施方式中，所述SARS
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CoV
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2病毒qPCR产品包括核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的负向引物。
[0024]本专利技术提供的重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体，通过对野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶进行点突变分子改造，从而实现了该酶热稳定性的提高，而且还提高了本产品的反转录效率和对长片段cDNA的反转录能力。此外，本专利技术还提供了能够表达上述突变体的重组表达载体，该重组表达载体转化进大肠杆菌后，能够高效表达上述突变体。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1为本专利技术实施例1提供的突变型M
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MLV的突变位点示意图；
[0027]图2为本专利技术实施例1中M
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MLV点突变PCR实验结果；
[0028]图3为本专利技术实施例2和实施例3表达的突变型M
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MLV的SDS
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PAGE结果；
[0029]图4为本专利技术实验例1中不同温度条件下逆转录cDNA产量。
具体实施方式
[0030]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体是野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶经过至少一个氨基酸残基的替换获得的，所述野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体具有如SEQ ID No.2所述的氨基酸序列。3.生物材料，其特征在于，包括以下任一项：(
ⅰ
)编码权利要求1或2所述突变体的核酸分子；(
ⅱ
)含有(
ⅰ
)所述核酸分子的重组载体，所述重组载体的原始载体为pET22b；(
ⅲ
)含有(
ⅰ
)所述核酸分子或(
ⅱ
)所述重组载体的转化体，所述转化体宿主选自大肠杆菌。4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述大肠杆菌选自E.coliRosetta或E.coliBL21。5.权利要求1或2所述突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括构建野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体，扩增得到线性重组表达载体DNA，线性重组表达载体DNA经定点突变后，使用同源重组酶进行环化得到突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体，将突变型重组鼠白血病病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁含文，
申请(专利权)人：南京巨匠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：