一种催化生成L-阿拉伯糖-1-磷酸的单糖激酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种催化生成L

【技术实现步骤摘要】
一种催化生成L-阿拉伯糖-1-磷酸的单糖激酶及其编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及一种催化生成L-阿拉伯糖-1-磷酸的单糖激酶及其编码基因与应用，属于糖类化合物合成


技术介绍

[0002]单糖-1-磷酸和核苷酸糖(也称糖核苷酸)是单糖的活化形式，在生物体内充当大多数糖基化反应的糖基供体，是碳水化合物代谢和糖缀合物生物合成中必不可少的中间体。在结构上，核苷酸糖由环化糖的半缩醛或半缩酮羟基与核苷单磷酸或二磷酸以磷酸酯键连接。核苷酸糖作为Leloir型糖基转移酶所必需的糖基供体，在糖链、糖蛋白、糖脂及糖修饰小分子酶促合成中必不可少。核苷酸糖对这些糖类化学物的合成、修饰、改造及其在医药等领域的应用具有重要价值。
[0003]L型阿拉伯糖是广泛存在于植物和微生物细胞结构中的一种天然单糖，尿苷二磷酸阿拉伯糖(英文名称：UDP-β-L-arabinopyranose，CAS编号15839-78-8，分离得到或人工合成后常以金属盐或铵盐形式存在，简称UDP-L-阿拉伯糖)是阿拉伯糖基转移酶的供体底物，是生物体中含L-阿拉伯糖的糖类化合物合成的必需前体。在植物中，尿苷二磷酸阿拉伯糖由两种途径合成，从头合成途径和补救合成途径，从头合成途径中UDP-葡萄糖先转化为UDP-葡萄糖醛酸，再转化为UDP-木糖，最后转化为UDP-L-阿拉伯糖，所涉及的酶反应步骤复杂且转化酶类需要特殊辅酶因子；补救合成途径中，游离的L-阿拉伯糖首先通过L-阿拉伯激酶(EC 2.7.1.46)转化为β-L-吡喃阿拉伯糖-1-磷酸(β-L-arabinopyranose-1-phosphate，本专利技术酶促合成的产物，在下文中不引起歧义时简称阿拉伯糖-1-磷酸)，然后尿苷二磷酸糖焦磷酸化酶(EC 2.7.7.64)使用尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)作为核苷酸供体将阿拉伯糖-1-磷酸转化为UDP-L-阿拉伯糖，反应底物简单、步骤少。
[0004]目前制备核苷酸糖的主要方法有化学合成和生物酶法两种。化学法合成由于需要多次保护、脱保护和选择性修饰等步骤，存在操作繁琐、产率低、污染环境等问题。生物酶法使用酶催化合成结构特定的核苷酸糖，操作简单、产率相对更高、环境友好。利用补救途径中的相关酶在体外反应是制备核苷酸糖及其衍生物的有效方法。对于UDP-L-阿拉伯糖，已有一种化学酶法结合的制备方法(Frontiers in Chemistry，Volume 6，Article 163)，其特征是，先通过化学法合成阿拉伯糖-1-磷酸，再通过尿苷二磷酸糖焦磷酸化酶AtUSP以化学合成的阿拉伯糖-1-磷酸为底物合成UDP-L-阿拉伯糖，此方法中化学合成的阿拉伯糖-1-磷酸为混合物，包括β-L-吡喃阿拉伯糖-1-磷酸和α-L-吡喃阿拉伯糖-1-磷酸，两者难以分离，而AtUSP只能利用β-L-吡喃阿拉伯糖-1-磷酸为底物，所以此方法具有化学反应步骤多，不经济不环保、酶反应效率低、先化学合成再酶反应耗时长等问题。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种催化生成L-阿拉伯糖-1-磷酸的单糖激
酶及其编码基因与应用，解决了生物酶法合成核苷酸糖过程中缺乏催化L-阿拉伯糖生成L-阿拉伯糖-1-磷酸的单糖激酶的问题，本专利技术从微生物Paludisphaera borealis中得到一种表现为L-阿拉伯糖激酶的蛋白序列，并将该酶应用于L-阿拉伯糖-1-磷酸和核苷酸糖UDP-L-阿拉伯糖的制备，实现了这两种活化阿拉伯糖化合物简单、高效的酶催化合成制备。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种催化生成L-阿拉伯糖-1-磷酸的单糖激酶PbAraK，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]根据本专利技术优选的，所述单糖激酶PbAraK以L-阿拉伯糖或L-核糖为底物生成相应的单糖-1-磷酸，镁离子、锰离子、铜离子或钙离子促进单糖激酶PbAraK的反应活性，EDTA抑制单糖激酶PbAraK的反应活性，单糖激酶PbAraK的反应pH为6～9，反应温度为25～65℃。
[0009]进一步优选的，所述单糖激酶PbAraK的反应pH为7.5～8.0，反应温度为37～45℃。
[0010]本专利技术中的单糖激酶PbAraK来源于微生物Paludisphaera borealis。
[0011]上述单糖激酶PbAraK的编码基因，编码上述单糖激酶PbAraK的氨基酸序列。
[0012]根据本专利技术优选的，所述单糖激酶PbAraK的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述核苷酸序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。
[0013]一种重组质粒，是在表达载体中插入上述单糖激酶PbAraK的编码基因构建得到。
[0014]根据本专利技术优选的，所述表达载体为含有T7启动子的载体，进一步优选为pET30a。
[0015]一种重组菌株，是将上述单糖激酶PbAraK的编码基因或上述重组质粒转化入宿主细胞中构建得到。
[0016]根据本专利技术优选的，所述宿主细胞为整合有DE3片段的菌株，进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0017]上述单糖激酶PbAraK的制备方法，包括步骤如下：
[0018]根据单糖激酶PbAraK的氨基酸序列设计单糖激酶PbAraK编码基因，人工合成单糖激酶PbAraK编码基因，插入到表达载体中，构建重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎细胞、色谱纯化得到重组单糖激酶PbAraK。
[0019]根据本专利技术优选的，所述单糖激酶PbAraK编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述表达载体为pET30a；所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述诱导表达采用终浓度为0.1-1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)或者0.1-1％乳糖；所述色谱纯化采用固定化金属离子亲和层析色谱；
[0020]进一步优选为，所述诱导表达采用终浓度为0.2-0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)或者0.1-0.4％乳糖；所述色谱纯化采用镍离子亲和层析色谱。
[0021]上述单糖激酶PbAraK在制备L-阿拉伯糖-1-磷酸中的应用。
[0022]根据本专利技术优选的，所述应用包括步骤：在水溶液中混合L-阿拉伯糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、金属离子，调节pH，加入单糖激酶PbAraK，温浴反应，终止反应，分离纯化得到L-阿拉伯糖-1-磷酸。
[0023]优选的，所述L-阿拉伯糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、金属离子在水溶液中的浓度均为10-300mM；所述金属离子为镁离子、锰离子、铜离子或钙离子；所述调节pH至6～9；所述单糖激酶PbAraK在水溶液中的浓度为0.01～2mg/mL；所述温浴反应的条件为25～65℃反应
3～24h；所述终止反应是煮沸2～10分钟终止反应。
[0024]进一步优选的，所述L-阿拉伯糖、腺嘌呤核苷三磷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种催化生成L-阿拉伯糖-1-磷酸的单糖激酶PbAraK，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的单糖激酶PbAraK，其特征在于，所述单糖激酶PbAraK以L-阿拉伯糖或L-核糖为底物生成相应的单糖-1-磷酸，镁离子、锰离子、铜离子或钙离子促进单糖激酶PbAraK的反应活性，EDTA抑制单糖激酶PbAraK的反应活性，单糖激酶PbAraK的反应pH为6～9，反应温度为25～65℃。3.权利要求1所述的单糖激酶PbAraK的编码基因，其特征在于，编码权利要求1所述的单糖激酶PbAraK的氨基酸序列；优选的，所述单糖激酶PbAraK的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种重组质粒，其特征在于，是在表达载体中插入权利要求3所述的单糖激酶PbAraK的编码基因构建得到；优选的，所述表达载体为含有T7启动子的载体；进一步优选为pET30a。5.一种重组菌株，是将权利要求3所述的单糖激酶PbAraK的编码基因或权利要求4所述的重组质粒转化入宿主细胞中构建得到；优选的，所述宿主细胞为整合有DE3片段的菌株，进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。6.权利要求1所述的单糖激酶PbAraK的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：根据单糖激酶PbAraK的氨基酸序列设计单糖激酶PbAraK编码基因，人工合成单糖激酶PbAraK编码基因，插入到表达载体中，构建重组质粒；将重组质粒转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎细胞、色谱纯化得到重组单糖激酶PbAraK；优选的，所述单糖激酶PbAraK编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述表达载体为pET30a；所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述诱导表达采用终浓度为0.1-1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)或者0.1-1％乳糖；所述色谱纯化采用固定化金属离子亲和层析色谱。7.权利要求1所述的单糖激酶PbAraK在制备L-阿拉伯糖-1-磷酸中的应用；优选的，所述应用包括步骤：在水溶液中混合L-阿拉伯糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、金属离子，调节pH，加入单糖激酶PbAraK，温浴反应，终止反应，分离纯化得到L-阿拉伯糖-1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘现伟，郑照萱，武小聪，刘静，李子涛，张静，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：