融合BsuDNA聚合酶和BsuDNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌制造技术

本发明专利技术提供了一种融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌，涉及生物技术领域。本发明专利技术提供的融合Bsu DNA聚合酶，含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段，能够在大肠杆菌中高效表达，表达纯度可达到95％以上。本发明专利技术提供的Bsu DNA聚合酶突变体，将融合Bsu DNA聚合酶中Bsu DNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala，缺失了3

【技术实现步骤摘要】
融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌。

技术介绍

[0002]分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化。聚合酶链式反应(PCR)作为一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，1985年由美国科学家Mullis专利技术了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。而DNA扩增在PCR技术是非常关键的一步。它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，因此常用于检测、鉴定传染性疾病、基因突变以及其他方面。然而，这种经典的技术需要一个温度循环仪器使双链DNA解链，再在等温条件下扩增目的片段。
[0003]随着分子生物学技术的革新，重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术应运而生，作为一项新型的恒温扩增技术，其独特的优势使得使不需借助精密温度循环系统进行等温核酸扩增逐渐成为可能。RPA技术包括3种关键组分，分别是重组酶(如T4 UvsX、E.coli recA等)、单链结合蛋白(如T4 gp32等)和链置换DNA聚合酶(如B.subtilis Pol I、S.aureus Pol等)。RPA技术的原理：重组酶与长约30
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35nt的引物结合形成的复合物在双链DNA模板中寻找靶位点；复合物在模板上定位后可以直接引发链交换反应形成D
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Loop结构，单链结合蛋白随即结合被置换的DNA链，稳定形成的D
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Loop结构并且防止引物解离；重组酶
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引物复合物主动水解体系中的ATP导致复合物构象改变，重组酶解离后引物3'端暴露并被DNA聚合酶识别，DNA聚合酶按照模板序列在引物3'端添加相应碱基，DNA扩增启动；链置换DNA聚合酶在延伸引物的同时继续解开模板的双螺旋DNA结构，DNA合成过程继续进行；两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子。以上步骤循环进行，实现DNA的指数增长。重组酶聚合酶扩增技术是一项由多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、高效、性价比高的特点。
[0004]重组酶聚合酶扩增技术中Bsu DNA聚合酶具有重要作用，在实际应用中，由于野生型Bsu DNA聚合酶存在一定的3
′→5′
核酸外切酶活性，导致在宿主细胞内的表达水平较低，所以目前获得的Bsu DNA聚合酶的纯度不高，而且Bsu DNA聚合酶基因在基因工程菌中的表达量低，量产化成本高，在恒温扩增效果也较差。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的在于提供一种融合Bsu DNA聚合酶，以解决上述问题中的至少
一种。
[0007]本专利技术的第二目的在于提供一种编码上述融合Bsu DNA聚合酶的基因。
[0008]本专利技术的第三目的在于提供一种重组质粒包括上述编码融合Bsu DNA聚合酶的基因。
[0009]本专利技术的第四目的在于提供一种基因工程菌，能够表达上述融合Bsu DNA聚合酶；
[0010]本专利技术的第五目的在于提供一种Bsu DNA聚合酶突变体，以解决上述问题中的至少一种。
[0011]本专利技术的第六目的在于提供一种编码上述Bsu DNA聚合酶突变体的基因。
[0012]本专利技术的第七目的在于提供一种重组质粒，包括上述编码Bsu DNA聚合酶突变体的基因。
[0013]本专利技术的第八目的在于提供一种基因工程菌，能够表达上述Bsu DNA聚合酶突变体。
[0014]本专利技术的第九目的在于提供一种上述融合Bsu DNA聚合酶或者Bsu DNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。
[0015]第一方面，本专利技术提供了一种融合Bsu DNA聚合酶，所述融合Bsu DNA聚合酶含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段；所述Bsu DNA聚合酶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；表达所述蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016]作为进一步技术方案，表达所述Bsu DNA聚合酶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0017]第二方面，本专利技术提供了一种编码上述融合Bsu DNA聚合酶的基因。
[0018]第三方面，本专利技术提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述编码融合Bsu DNA聚合酶的基因；
[0019]所述载体包括pET
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22b。
[0020]第四方面，本专利技术提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒；
[0021]所述基因工程菌包括大肠杆菌。
[0022]第五方面，本专利技术提供了一种Bsu DNA聚合酶突变体，将融合Bsu DNA聚合酶中Bsu DNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala。
[0023]第六方面，本专利技术提供了一种编码上述Bsu DNA聚合酶突变体的基因。
[0024]第七方面，本专利技术提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述编码Bsu DNA聚合酶突变体的基因；
[0025]所述载体包括pET
‑
22b。
[0026]第八方面，本专利技术提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒；
[0027]所述基因工程菌包括大肠杆菌。
[0028]第九方面，本专利技术提供了一种融合Bsu DNA聚合酶或者Bsu DNA聚合酶突变体在制备核酸扩增产品中的应用。
[0029]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0030]本专利技术提供的融合Bsu DNA聚合酶，含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段，能够在大肠杆菌中高效表达，表达的融合Bsu DNA聚合酶纯
度可达到95％以上，得率高，能够实现批量生产，具备非常出色的DNA聚合酶效能。
[0031]本专利技术提供的Bsu DNA聚合酶突变体，以上述融合Bsu DNA聚合酶为模板，将融合Bsu DNA聚合酶中Bsu DNA聚合酶片段的第41位Aps突变为Glu，第194位Val突变为Ala，缺失了3
′→5′
核酸外切酶活性，能够在大肠杆菌中高效表达，表达的融合Bsu DNA聚合酶纯度可达到97％以上，能够实现恒温扩增。
附图说明
[0032]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合Bsu DNA聚合酶，其特征在于，所述融合Bsu DNA聚合酶含有Bsu DNA聚合酶片段和融合于所述Bsu DNA聚合酶片段N端的蛋白片段；所述Bsu DNA聚合酶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；表达所述蛋白片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的融合Bsu DNA聚合酶，其特征在于，表达所述Bsu DNA聚合酶片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.编码权利要求1或2所述的融合Bsu DNA聚合酶的基因。4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括载体和权利要求3所述的基因；所述载体包括pET
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22b。5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁含文，
申请(专利权)人：南京巨匠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：