尿苷-胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了尿苷

【技术实现步骤摘要】
尿苷
‑
胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用


[0001]本专利技术涉及尿苷
‑
胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用，属于酶工程和生物催化领域。

技术介绍

[0002]核苷酸主要参与构成核酸，且具有重要的生物学功能。核苷酸及其衍生物可广泛应用与农业生产、食品、医药等领域。化学法合成核苷酸通常以三氯氧磷为磷酸供体，将核苷直接磷酸化生产相应核苷酸。但此种化学法合成5
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胞苷酸时，需要在核糖的2
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,3
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羟基上加上保护基团，再进行磷酸化反应。化学法合成核苷酸操作步骤多、路线长、立体选择性差、试剂昂贵且试剂有毒、可操作性差、生产成本高，不适合大规模绿色生产。
[0003]核糖核酸(RNA)降解也可以用于生产5
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胞苷酸，需要经分离纯化获得纯的5
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胞苷酸。该方法可以一次获得4种产物，但除了5
’‑
胞苷酸外，其他三种均为反应的副产物。同时，作为降解的原料(RNA)也存在诸多限制，如RNA的来源并不广泛，而且该降解RNA生产5
’‑
胞苷酸工艺中的分离操作复杂，目标产物收率降低。
[0004]采用酶催化方法，以胞苷为底物生产胞苷酸，酶催化反应具有诸多优点，例如较为温和、对环境、设备及操作人员均无害。重组表达酶的菌株，经过细胞破壁后，离心分离上清液，采用含有粗酶液的细胞破壁上清液直接催化底物生产胞苷酸，减少了酶蛋白的纯化、分离等操作步骤，极大的简化了生产工艺，节约了生产成本。例如，记载于公开号为CN111269870A的专利技术专利中，采用重组大肠杆菌表达胞苷激酶，采用粗酶液催化底物胞苷及ATP，转化生成胞苷酸的转化率可达85％。但其酶的催化效率没有达到足够高的水平，这将降低酶催化反应的效率，增加生产周期，通过蛋白质工程，因此，一种对酶蛋白进行分子改造，进而提高酶的催化效率的方法十分必要。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，采用定点突变技术对尿苷
‑
胞苷激酶进行定点突变，提高尿苷
‑
胞苷激酶的催化效率，并耦合乙酸激酶进行催化，高效催化5
’‑
胞苷生产5
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胞苷酸，可以高效生产5
’‑
胞苷酸(5
’‑
CMP)，促进其在医药等领域中的应用。
[0006]本专利技术提供了一种尿苷
‑
胞苷激酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷
‑
胞苷激酶的第100位进行突变得到的。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述尿苷
‑
胞苷激酶来源于大肠杆菌。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述尿苷
‑
胞苷激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体为：
[0010]将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷
‑
胞苷激酶的第100位的组氨酸突变为苯丙氨酸得到的，突变体命名为H100F；
[0011]或，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷
‑
胞苷激酶的第100位的组氨酸突变
为酪氨酸得到的，突变体命名为H100Y。
[0012]本专利技术还提供了编码上述尿苷
‑
胞苷激酶突变体的基因。
[0013]本专利技术还提供了携带上述基因的重组载体。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体以pET22b质粒、pET28a质粒或pRSFDuet
‑
1质粒为表达载体。
[0015]本专利技术还提供了携带上述基因，或上述重组载体的微生物细胞。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
[0017]本专利技术还提供了一种生产5
’‑
胞苷酸(5
’‑
CMP)的方法，所述方法为：将上述尿苷
‑
胞苷激酶突变体，或上述微生物细胞添加至含有胞苷、磷酸盐、Mg
2+
、GTP、乙酸激酶的反应体系中，进行反应制备得到。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述乙酸激酶来源于保加利亚乳杆菌。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述乙酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述乙酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0021]在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中，胞苷添加的终浓度为40～100mM。
[0022]在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中，磷酸盐添加的终浓度为10～100mM。
[0023]在本专利技术的一种实施方式中，所述磷酸盐为：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液。
[0024]在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中，Mg
2+
添加的终浓度为1～50mM。
[0025]在本专利技术的一种实施方式中，所述Mg
2+
为：MgCl2或MgSO4。
[0026]在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中，GTP添加的终浓度为0.1～6mM。
[0027]在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中，尿苷
‑
胞苷激酶突变体的添加量为1～10U/mL。
[0028]在本专利技术的一种实施方式中，反应体系中，乙酸激酶的添加量为1～10U/mL。
[0029]本专利技术还提供了上述尿苷
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胞苷激酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述重组大肠杆菌在制备胞苷酸，或含有胞苷酸的产品中的应用。
[0030]在本专利技术的一种实施方式中，所述产品为化学品。
[0031]有益效果
[0032](1)本专利技术通过采用定点突变技术对尿苷
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胞苷激酶进行定点突变，提高尿苷
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胞苷激酶的催化效率，酶突变体的催化效率最高提高至对照的1.7倍；采用相同的质粒pRSFDuet共表达基因udk和ack，混合后实现尿苷
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胞苷激酶耦合乙酸激酶的高效催化，减少单一质粒表达尿苷
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胞苷激酶后酶的用量。
[0033](2)本专利技术的尿苷
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胞苷激酶突变体可高效催化5
’‑
胞苷生产5
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胞苷酸，可以高效生产5
’‑
胞苷酸(5
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CMP)，转化效率可达98％以上。采用本专利技术获得的尿苷
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胞苷激酶突变体，并耦合乙酸激酶后，可以高效生产5
’‑
胞苷酸，可促进其在医药等领域中的应用。
附图说明
[0034]图1：重组菌E本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种尿苷
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胞苷激酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷
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胞苷激酶的第100位进行突变得到的。2.如权利要求1所述的尿苷
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胞苷激酶突变体，其特征在于，所述突变体为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷
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胞苷激酶的第100位的组氨酸突变为苯丙氨酸得到的，突变体命名为H100F；或，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的尿苷
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胞苷激酶的第100位的组氨酸突变为酪氨酸得到的，突变体命名为H100Y。3.编码权利要求1或2所述的尿苷
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胞苷激酶突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的重组载体。5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体以pET22b质粒、pET28a质粒或pRSFDuet
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1质粒为表达载体。6.携带权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述的重组载体的微生物细胞。7.如权利要求6所述的微...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海泉，张玮琪，张飞龙，张剑，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：