一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法，属于高通量筛选和工业微生物菌种选育技术领域，包括如下步骤：(1)取待筛选产黄支顶孢霉单菌落，制成单菌落混悬液，并使用亚精胺进行培养前处理；(2)将处理后的单菌落混悬液涂布于添加有pH指示剂的固体发酵培养基上，进行培养；(3)培养后根据固体发酵培养基的颜色变化筛选产黄支顶孢霉；头孢菌素C产量与发酵后pH值呈负相关。本发明专利技术方法培养及筛选过程简便、快捷，筛选效率高，适于推广应用。应用。应用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法


[0001]本专利技术属于高通量筛选和工业微生物菌种选育
，具体涉及一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法。

技术介绍

[0002]头孢菌素C(cephalosporin C，英文简写CPC)是产黄支顶孢霉(Acremonium chrysogenum)合成代谢的一种重要的β
‑
内酰胺抗生素，是生产头孢类抗生素母核7
‑
氨基头孢烷酸(7
‑
Aminocephalosporanic acid，英文简写7
‑
ACA)的关键前体物质。因此筛选CPC高产菌株一直是头孢类抗生素工业的重点研究方向。
[0003]CPC高产菌株的传统育种方法是使用摇瓶液体发酵培养，测定发酵液中的CPC含量，以筛选产黄支顶孢霉突变菌株，但该方法需要使用大量的摇瓶和摇床设备，菌种无菌制备和培养基配制工艺十分复杂，导致培养和筛选通量均十分有限。而高通量的微孔板培养方法在很长一段时间被证明在实际应用过程中非常困难，因为产黄支顶孢霉不仅形态多变，而且培养条件要求十分苛刻；产黄支顶孢霉菌丝在培养液中或是自由分散或是聚集成团生长，菌丝自由分散增加培养液粘度，影响培养体系通气；而成团生长粘度降低，造成营养供应的不均匀。因此，目前关于产黄支顶孢霉研究的瓶颈已经从遗传突变菌株的产生，转移到突变菌株培养和筛选条件参数的优化方面。如何提供一种产黄支顶孢霉高通量筛选是本领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术公开了一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法，培养及筛选过程简便、快捷，筛选效率高，适于推广应用。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法，包括如下步骤：
[0007](1)取待筛选产黄支顶孢霉单菌落，制成单菌落混悬液，并使用亚精胺进行培养前处理；
[0008](2)将处理后的单菌落混悬液涂布于添加有pH指示剂的固体发酵培养基上，进行培养；
[0009](3)培养后根据固体发酵培养基的颜色变化筛选产黄支顶孢霉；头孢菌素C产量与发酵后pH值呈负相关。
[0010]经大量实验研究发现，高产头孢菌素C的产黄支顶孢霉在发酵后pH降至5.50
±
0.30，且头孢菌素C产量与发酵后pH值呈负相关，因此，利用这一规律，使用添加有pH指示剂的固体发酵培养基进行产黄支顶孢霉的发酵培养，根据颜色变化筛选产黄支顶孢霉，可保证较高的筛选正确率，并且有效简化筛选工艺。
[0011]进一步地，步骤(1)中，
[0012]经诱变育种获得的突变株，经遗传改造策略改造后的基因突变株(如经过基因工
程、基因编辑或系统代谢工程改造的菌株)，或由于菌种退化需要进行复壮的分离单菌株均可作为待筛选产黄支顶孢霉。
[0013]进一步地，步骤(1)中，
[0014]待筛选产黄支顶孢霉单菌落制成单菌落混悬液后，使用亚精胺
‑
PBS磷酸盐缓冲液进行培养前处理；
[0015]使用亚精胺
‑
PBS磷酸盐缓冲液对待筛选产黄支顶孢霉单菌落进行混悬处理，制成单菌落混悬液；
[0016]所述亚精胺
‑
PBS磷酸盐缓冲液中亚精胺的浓度为1.0～10.0mmol/L；
[0017]所述培养前处理时间为20
‑
30min。
[0018]进一步地，步骤(2)中，
[0019]所述固体发酵培养基配方为：
[0020]果糖，20～30g/L；可溶性淀粉，15～30g/L；金枪鱼膏，15～25g/L；DL
‑
甲硫氨酸，10～15g/L；硫酸铵，15～25g/L；聚蛋白胨，20～30g/L；MgSO4·
7H2O，2～3g/L；FeSO4·
7H2O，1～2g/L；玉米浆，10～15mL/L；α
‑
淀粉酶0.1～0.2g/L；琼脂糖，10～15g/L；pH＝7.20
±
0.05；
[0021]进一步地，步骤(2)中，
[0022]所述pH指示剂包括溴甲酚蓝、溴甲酚紫、茜素磺酸钠、乙氧基黄叱精、儿茶酚紫、甲基红、溴百里酚蓝或二苯氨基脲等；
[0023]所述pH指示剂在固体发酵培养基中的添加浓度为0.1～10mmol/L。
[0024]进一步地，步骤(2)中，
[0025]所述固体发酵培养基置于孔板中；
[0026]培养条件为25
‑
30℃培养7d。
[0027]进一步地，步骤(3)中，
[0028]对于头孢菌素C产量发生正突变的潜力高产产黄支顶孢霉而言，发酵后pH降至5.50
±
0.30。
[0029]进一步地，步骤(3)中，
[0030]对于头孢菌素C产量发生正突变的潜力高产产黄支顶孢霉而言，固体发酵培养基颜色发酵前后的变化分别为：
[0031]添加溴甲酚蓝，从深蓝紫色变为浅土黄色；
[0032]添加溴甲酚紫，从深紫色变为浅黄色；
[0033]添加茜素磺酸钠，从土橙红色变为土红色；
[0034]添加乙氧基黄叱精，从黄色变为土红色；
[0035]添加儿茶酚紫，从青紫色变为黄色；
[0036]添加甲基红，从土红色变为土黄色；
[0037]添加溴百里酚蓝，从深蓝色变为黄绿色；
[0038]添加二苯氨基脲，从深紫色变为土黄色。
[0039]进一步地，固体发酵培养基中的固化用成分为琼脂糖或琼脂；经前期研究工作发现，头孢菌素C在琼脂糖或琼脂形成的固体培养基中具有良好的扩散性，因此，可以通过检测发酵终点时固体发酵培养基中的头孢菌素C含量，作为高产菌株的筛选依据；
[0040]上述高通量筛选方法还包括头孢菌素C含量的测定：
[0041]将培养后带有菌体的固体发酵培养基加入无菌缓冲体系打碎，使用琼脂糖酶进行酶解，离心过滤后进行HPLC检测，筛选高产头孢菌素C的菌株。
[0042]进一步地，所述无菌缓冲体系包括水或缓冲液；
[0043]酶解温度为37
‑
42℃，酶解时间为20
‑
30min。
[0044]综上所述，本专利技术公开了一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法，相较于传统的药瓶液体发酵培养筛选方法简化了培养基筛选工艺，并且筛选正确率达80％以上，适于诱变育种、适应性进化或基因工程育种等处理后的高产突变株筛选以及退化的菌种复壮。
附图说明
[0045]图1所示为500株产黄支顶孢霉突变菌株摇瓶液体发酵结束后CPC含量及pH比较；
[0046]图2所示为500株产黄支顶孢霉突变菌株摇瓶液体发酵和孔板固体发酵结束后CPC含量比较；
[0047]图3所示为500株产黄支顶孢霉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取待筛选产黄支顶孢霉单菌落，制成单菌落混悬液，并使用亚精胺进行培养前处理；(2)将处理后的单菌落混悬液涂布于添加有pH指示剂的固体发酵培养基上，进行培养；(3)培养后根据固体发酵培养基的颜色变化筛选产黄支顶孢霉；头孢菌素C产量与发酵后pH值呈负相关。2.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待筛选产黄支顶孢霉包括经诱变育种获得的突变株，经遗传改造策略改造后的基因突变株，或由于菌种退化需要进行复壮的分离单菌株。3.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，待筛选产黄支顶孢霉单菌落制成单菌落混悬液后，使用亚精胺
‑
PBS磷酸盐缓冲液进行培养前处理；所述亚精胺
‑
PBS磷酸盐缓冲液中亚精胺的浓度为1.0～10.0mmol/L；所述培养前处理时间为20
‑
30min。4.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述固体发酵培养基配方为：果糖，20～30g/L；可溶性淀粉，15～30g/L；金枪鱼膏，15～25g/L；DL
‑
甲硫氨酸，10～15g/L；硫酸铵，15～25g/L；聚蛋白胨，20～30g/L；MgSO4·
7H2O，2～3g/L；FeSO4·
7H2O，1～2g/L；玉米浆，10～15mL/L；α
‑
淀粉酶0.1～0.2g/L；琼脂糖，10～15g/L；pH＝7.20
±
0.05。5.根据权利要求1所述的一种基于固体发酵的产黄支顶孢霉高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁恒宇，幸志伟，李林，郭慧萍，杨梦园，李雪亮，张敏，韩超，陈民良，周鹏，张皓，
申请(专利权)人：河南省健康元生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：