一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用，所述评价方法包括如下步骤制备铁牛奶培养基、培养纯种的产气荚膜梭菌、在铁牛奶培养基中接种产气荚膜梭菌纯种培养液和待评价的抑菌剂，置于46

【技术实现步骤摘要】
一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用。
技术背景
[0002]饲粮禁止使用抗生素以后，畜禽养殖上问题频发，肠炎等问题更为突出，不仅严重影响畜禽肠道健康，而且造成巨大的经济损失，因此禁抗后畜禽养殖最重要的就是关注肠道健康问题。目前，坏死性肠炎是畜禽肠道健康面临的巨大挑战，而产气荚膜梭菌是导致坏死性肠炎的最主要因素之一。
[0003]目前各大养殖终端一般采取添加益生菌、中草药提取物等添加剂对产气荚膜梭菌进行抑制以防控坏死性肠炎。但是这些添加剂对产气荚膜梭菌的抑菌效果究竟怎么样，需要进行评价，有确定的效果才能引入规模化饲料生产中，目前对于产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法一般有两种方式：动物试验评价和实验室体外评价。所述动物试验评价一般通过动物的采食量、死淘率、肠道病理切片、肠道菌群的变化来评价，试验周期较长，对成本、场地要求较高，不确定因素较多。所述实验室体外评价一般采用牛津杯平板法，该方法通过添加剂抑制产气荚膜梭菌的生长在平板上形成透明圈，通过透明圈的直径来评判抑菌效果。这种方法受限于产气荚膜梭菌的菌种特性（厌氧培养，产气），实验周期长。在目前有关产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果评价的文献中，大多采用这种方法。
[0004]牛津杯平板法的原理是平板培养基用胰胨
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亚硫酸盐
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环丝氨酸盐琼脂基础（TSC）,其中含有的柠檬酸铁铵与偏重亚硫酸钠吸收产气荚膜梭菌生长过程中产生的硫化氢，使得平板变黑；添加抑菌剂抑制了菌体硫化氢的生长，形成透明圈。但在实践中发现，牛津杯法的试验效果不稳定，随着产气荚膜梭菌的产气量的变化，平板经常全部变黑，需要经过日光脱色来进行抑菌圈直径的测量，而脱色时间不好把控，一旦时间过长，平板完全脱色，无法比对抑菌效果。
[0005]基于对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果准确评价的需求，饲料企业引入暴烈发酵法进行评价。所暴烈发酵法引自国标GB4789
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2012产气荚膜梭菌检验，其原理：培养基中含全脂牛奶和硫酸亚铁，其中全脂牛奶中含有乳糖，硫酸亚铁提供低的氧化还原电势，产气荚膜梭菌生长过程中发酵乳糖、凝固酪蛋白并大量产气，乳凝结物破碎快速形成海绵样物质，产生暴烈发酵现象。可以推知，当存在抑菌因子时，可以抑制产气荚膜梭菌生长，不会出现“暴烈发酵”现象，因此用暴烈发酵法操作简单、设备要求低、实验周期短，可以对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果进行快速评估。
[0006]但是该方法在实际对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果进行评价时遇到了许多问题，主要是培养基的试验效果不稳定。不管是自制培养基还是商品化培养基，常见的问题就是培养基在使用前就出现少量结块（凝乳现象）、产气荚膜梭菌在培养基中不生长导致对抑菌效果的误判等等。在目前饲料禁抗的背景下，对各类产气荚膜梭菌抑菌剂的准确评价就非常重要，现有技术的误判率高，对饲料企业转型造成非常不利的影响，因此急需对现有的
对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法进行改进。

技术实现思路

[0007]为了解决以上问题，本专利技术提出一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法及其应用。
[0008]本专利技术提供了一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法，所述评价方法包括如下步骤：步骤1）、制备铁牛奶培养基：所述铁牛奶培养基组分为脱脂奶粉100.0g、七水硫酸亚铁1.0g、蒸馏水1050.0ml，制备方法为将脱脂奶粉溶于蒸馏水中，不断搅拌，加入七水硫酸亚铁，混合混匀，分装于大试管中，每管10mL，分装完成，给大试管盖上硅胶塞，用牛皮纸包裹，然后100℃沸水浴10min灭菌；所述铁牛奶培养基须新鲜配制；步骤2）、培养纯种的产气荚膜梭菌：将产气荚膜梭菌模式菌株冻存液接种入液体硫乙醇酸盐培养基中，37℃静置培养2d后，得到产气荚膜梭菌的纯种培养液；步骤3）、在步骤1）获得的铁牛奶培养基中接种步骤2）获得的产气荚膜梭菌纯种培养液1ml和待评价的抑菌剂1ml，置于46
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48℃水浴培养5h，即可观察试验结果，产生暴烈发酵现象的评价为无抑菌效果，暴烈发酵现象被抑制的评价为有抑菌效果。
[0009]优选地，所述步骤1）中100℃沸水浴10min灭菌。
[0010]本专利技术提供的产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法应用在饲料生产和畜禽养殖生产上。
[0011]本专利技术的有益效果如下：国标GB4789
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2012产气荚膜梭菌检验中的暴烈发酵法是针对食品中是否含有产气荚膜梭菌的检测方法，但在饲料和养殖企业快速评价产气荚膜梭菌抑菌剂抑菌效果的生产实践上却并不适用。本专利技术在暴烈发酵法的基础上，确定了100℃沸水浴10
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25min灭菌制备铁牛奶培养基，然后进行水浴5h后即可有效辨别产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果，实现快速高效筛选气荚膜梭菌抑菌剂。本专利技术的方法操作简单、设备要求低、实验周期短，可以对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果进行快速评估。
[0012]采用本专利技术优化的暴烈发酵法后，结果显示抗生素组和益菌健组都可以有效抑制产气荚膜梭菌的暴烈发酵现象，而无抗对照组产气荚膜梭菌组暴烈发酵现象明显，同时竞品组没能有效抑制产气荚膜梭菌的暴烈发酵现象，证明该方法可以用于产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果评价，快速筛选可替代抗生素的产气荚膜梭菌抑菌剂，为饲粮禁抗环境下饲料企业和养殖企业快速筛选可以大规模商用的产气荚膜梭菌抑菌剂提供了有力的保障。
附图说明
[0013]图1为实施例1中A组制备的铁牛奶培养基；图2为实施例1中D组制备的铁牛奶培养基；图3为实施例1中D组进行暴烈发酵实验的状态对比图；其中1为无抗对照组、2为抗生素组、3为益菌健组；图4为实施例3中100℃水浴不同时间的培养基灭菌后的状态对比图；图5为实施例5对不同产气荚膜梭菌抑菌剂进行暴烈发酵实验的状态对比图。
具体实施方式
[0014]以下结合实施例对本专利技术作进一步说明。
[0015]实施例1 新鲜牛奶和脱脂奶粉分别使用118℃高压灭菌方式和水浴灭菌方式进行除菌和暴烈发酵对比实验。
[0016]A组：新鲜全脂牛奶1000.0ml、硫酸亚铁（FeSO4
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7H2O）1.0g、蒸馏水50.0ml；制备方法为：将1.0g硫酸亚铁溶于50.0ml蒸馏水中，不断搅拌，缓慢加入1000.0ml新鲜全脂牛奶中，混匀，分装大试管（规格18
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180mm），每管10mL，118℃高压灭菌12min，时间到后，立刻冷却至室温。（见图1）。
[0017]B组：脱脂奶粉100.0g、硫酸亚铁（FeSO4
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7H2O）1.0g、蒸馏水1050.0ml；制备方法为：将100.0g脱脂奶粉溶于1050.0ml蒸馏水中，不断搅拌，加入1.0g硫酸亚铁，混合混匀，分装大试管（规格18
×
180mm），每管10m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对产气荚膜梭菌抑菌剂的抑菌效果的评价方法，其特征在于，所述评价方法包括如下步骤：步骤1）、制备铁牛奶培养基：所述铁牛奶培养基组分为脱脂奶粉100.0g、七水硫酸亚铁1.0g、蒸馏水1050.0ml，制备方法为将脱脂奶粉溶于蒸馏水中，不断搅拌，加入七水硫酸亚铁，混合混匀，分装于大试管中，每管10mL，分装完成，给大试管盖上硅胶塞，用牛皮纸包裹，然后100℃沸水浴10
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25min灭菌；所述铁牛奶培养基须新鲜配制；步骤2）、培养纯种的产气荚膜梭菌：将产气荚膜梭菌模式菌株冻存液接种入液体硫乙醇酸盐培养基中...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙敏，华跃飞，李爽，李阳，张广民，蔡辉益，
申请(专利权)人：天津博菲德科技有限公司，
类型：发明
国别省市：