一种发酵液中5-氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法技术

本发明专利技术涉及一种发酵液中5

【技术实现步骤摘要】
一种发酵液中5
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氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法


[0001]本专利技术涉及饲料组分检测领域，具体涉及一种发酵液中5
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氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法。

技术介绍

[0002]5‑
氨基乙酰丙酸(5
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ALA)是生物体内四吡咯和卟啉合成的前体，可作为新一代光动力学剂用作除草剂、杀虫剂、抗微生物药剂、植物生长促进剂及医学诊断，越来越受到关注。然而，关于5
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ALA 发酵生产方面的研究较少，特别是关于对发酵过程中的目标代谢产物及时准确的监测方面很少有人研究。目前主要采用微生物发酵技术生产5
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ALA，在5
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ALA合成酶的作用下将琥珀酰CoA 和甘氨酸缩合为5
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ALA是目前发酵法生产5
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ALA的主要途径。
[0003]当前使用微生物发酵技术生产5
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ALA中需要使用甘氨酸作为5
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ALA合成的前体物质，所以在发酵中需要及时准确的测定发酵中甘氨酸含量与5
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ALA含量，进而计算当前阶段甘氨酸与产物的转化率，了解微生物状态，进而更好的对发酵条件进行控制，促进产物合成。另外，5
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ALA在溶液中很不稳定, 温度、浓度 、pH、溶氧都会引起它两分子缩合产生其它物质。因此, 寻找一种快速、简便、稳定的检测方法十分重要。
[0004]当前5
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ALA与甘氨酸含量的主要检测方法有两种：一是分光光度法：目前检测5
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ala含量大多数使用化学显色法测定，该方法原理为5
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ALA与乙酰丙酮在pH4.6的乙酸
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乙酸钠缓冲溶液中（100℃、15min水浴）能够发生缩合，生成吡咯衍生物，此衍生物在强酸介质中形成橙红色物质，在553nm波长下，进行检测。该方法每次测定都需要配制新的标准液进行新的标准曲线绘制，中间过程需要使用高氯酸以及乙酰丙酮等有毒强酸危险化学药品，操作过程繁琐，每次测量耗时2小时，而5
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ala发酵生产中，需要及时跟踪前体物质消耗速率以及合成物质的合成速率，从而做到生产环节的及时把控，而该方法做不到产物测量的及时跟踪，也做不到对前体物质含量进行跟踪。
[0005]二是丹黄酰氯（DST）检测法：当前有一些文献报道中使用丹黄酰氯衍生化法对甘氨酸与5
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ALA同时进行测定，该方法利用丹黄酰氯（DST）对显性胺基团的亲和性，在碱性条件下将胺基团转化为丹黄酰胺基团，从而使分析物中的含氮化合物生成丹黄酰胺衍生物。但该方法衍生时间较长（1h），过程中操作步骤繁琐，并且，样品洗脱时间较长，检测中杂峰较多，每次测定耗时2小时以上，仍无法做到对生产的及时跟踪。
[0006]甘氨酸与5
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ALA为两种伯胺类物质，而荧光胺是一种伯胺类物质的特效衍生剂，可以特异性的与伯胺类物质产生荧光，而荧光胺本身不具有荧光性，在水中也会水解为非荧光物质，因此对检测峰形不会产生干扰，并且荧光胺与伯胺类物质衍生时间较短，可以显著减少检测时间，因此将采用荧光胺作为衍生试剂进行方法优化。但是，由于菌体发酵生产5
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ALA的发酵液中会产生一些含伯胺类物质，与荧光胺特异性反应，会出来其他杂峰，而现有检测方法中都没有考虑到分离这些杂峰，但杂峰不分离出来对5
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ALA和甘氨酸的检测会造成影响。
[0007]由此可见，现有技术无法满足生产需要，因此急需一种操作方式简单衍生时间短
同时整体检测时间短的方法，可以有效帮助对生产过程中各个重要环节的掌握和调节，以更加高效生产5
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ALA。

技术实现思路

[0008]为了解决以上问题，本专利技术提出一种发酵液中5
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氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法。
[0009]本专利技术提供的发酵液中5
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氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法，使用HPLC
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荧光法进行测定，具体步骤如下：步骤1）取发酵液5mL于离心管中，4000r/min离心5分钟；步骤2）取上述离心管中的上清液0.1mL置于100mL容量瓶中，定容，摇匀；步骤3）取上述容量瓶中的溶液100μL于1.5mL离心管中，加入100μL的0.1%的荧光胺丙酮溶液，再加入200μL的BBS缓冲液，再加入100μL的0.5%三乙胺溶液，使用振荡器震荡1min，静置3
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5min后，微滤到进样瓶中，进行检测。
[0010]其中，色谱条件及程序设置为：流动相为：A相：0.1%三氟乙酸溶液；B相：乙腈； 采用梯度洗脱方式；色谱柱温度：35℃；进样体积：10μL；激发波长：398nm；发射波长：480nm；流速：1.4mL/min。
[0011]优选地，所述BBS缓冲液为0.46g十四水硼酸钠和0.51g硼酸溶解定容到100mL容量瓶。
[0012]优选地，所述梯度洗脱方式的AB相比例和程序如下表所示：
[0013]本专利技术的有益效果如下：1、本专利技术的方法可以同时检测发酵液中5
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氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量。
[0014]2、本专利技术的方法在细节上进行优化，解决了采用常规HPLC
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荧光法进行测定时，图谱中存在峰形未分离、峰未回归基线、峰形不对称、峰形存在扫尾等问题。
[0015]3、本专利技术的方法在检测5
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ALA在0.1
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50ppm间有着良好的线性关系，在检测甘氨酸在0.5
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50ppm间有着良好的线性关系，获得的结果准确度高，重复性好。
[0016]4、本专利技术的方法回收率很好，适用于生产需求。
[0017]5、本专利技术的方法同时检测发酵液中5
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氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量，用时短，只需25min，比现有检测技术的平均2小时出结果快得多，操作简单，重复性和准确度高，为高效生产5
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ALA提供了有力的保障。
附图说明
[0018]图1为实施例1的检测图谱部分峰形截图；图2为实施例2中2.1的检测图谱部分峰形截图；图3为实施例2中2.2的检测图谱部分峰形截图；图4为实施例2中2.3的检测图谱部分峰形截图；
图5为实施例2中2.4的检测图谱部分峰形截图；图6为实施例2中2.5的检测图谱部分峰形截图；图7为实施例2中2.6的检测图谱部分峰形截图；图8为实施例2中2.7的检测图谱部分峰形截图；图9为实施例2中2.8的检测图谱部分峰形截图；图10为实施例2中2.9的检测图谱部分峰形截图；图11为实施例2中2.10的检测图谱部分峰形截图；图12为实施例2中2.11的检测图谱部分峰形截图；图13为实施例2中2.12的检测图谱部分峰形截图；图14为实施例3的甘氨酸标准曲线；图15为实施例3的5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵液中5
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氨基乙酰丙酸和甘氨酸含量的测定方法，其特征在于，使用HPLC
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荧光法进行测定，具体步骤如下：步骤1）取发酵液5ml于离心管中，4000r/min离心5分钟；步骤2）取上述离心管中的上清液0.1ml置于100ml容量瓶中，定容，摇匀；步骤3）取上述容量瓶中的溶液100μL于1.5mL离心管中，加入100μL的0.1%的荧光胺丙酮溶液，再加入200μL的BBS缓冲液，再加入100μL的0.5%三乙胺溶液，使用振荡器震荡1min，静置3
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5min后，微滤到进样瓶中，进行检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁艺超，华跃飞，李爽，张广民，蔡辉益，
申请(专利权)人：天津博菲德科技有限公司，
类型：发明
国别省市：