一种提高5-羟基色氨酸微生物转化浓度的方法技术

本发明专利技术提供一种5

【技术实现步骤摘要】
一种提高5
‑
羟基色氨酸微生物转化浓度的方法


[0001]本专利技术属于基因工程和生物催化领域，具体涉及一种用于生产L
‑5‑
羟基色氨酸的大肠杆菌工程菌的构建及其在提高5
‑
羟基色氨酸微生物转化浓度中的应用。

技术介绍

[0002]5‑
羟色氨酸(5
‑
hydroxytryptophan,5
‑
HTP)是一种氨基酸类物质,是L
‑
色氨酸代谢的一种产物，也是重要的抑制神经传递素5
‑
羟色胺(血清素,serotonin，5
‑
HT)的前体物质，后者又是作为人体内激素褪黑素(Melatonine，MT)的前体物质。摄入5
‑
羟色氨酸能有效帮助产生血清素，因此可促进情绪、神经系统的健康。一些双盲研究表明，5
‑
羟色氨酸可抑制食欲，减少脂肪摄取，减少焦虑，控制情绪，促进睡眠。
[0003]5‑
羟色氨酸的制备方式主要是植物提取，来源于非洲的木本攀援灌木加纳(Griffonia simplicifolia)的种子。由于加纳籽产量受季节、地理等因素限制，天然提取的5
‑
HTP价格波动大，提取成本高。
[0004]化学合成来制备5
‑
羟基色氨酸的方法主要受限于两个因素，即5
‑
羟基吲哚基团的低成本合成和氨基所在碳原子的手性控制。如在CN102212028A中，5
‑
羟基吲哚基团是由3
‑
甲基
‑4‑
硝基苯酚或者以3
‑
甲基苯酚为原料，经多步保护、缩合等反应合成的。而手性的控制则引入了酶拆分的因素。整个过程中保护脱保护步骤，和拆分等成本造成化学合成法不具备价格优势。
[0005]近年来，微生物转化和发酵法生产成为一条制备5
‑
羟基色氨酸的良好的途径。根据其核心反应中生成5
‑
HTP的方式，可分成两类：
[0006]1.利用L
‑
色氨酸
‑5‑
羟化酶(Tryptamine 5
‑
hydroxylase,T5H)将L
‑
色氨酸氧化转化为L
‑5‑
羟基色氨酸，如CN106414755A，CN101864466A所述。
[0007]2.利用L
‑
色氨酸合酶(Tryptophan synthase)的底物杂泛性，以5
‑
羟基吲哚和丝氨酸(或半胱氨酸)为底物合成L
‑5‑
羟基色氨酸，如CN102808008A、Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,11577
–
11581所述。其中的5
‑
羟基吲哚在生物体内的合成，可以利用邻氨基苯甲酸的羟化后，引入吲哚合成的基本通路实现，如ACS Synth.Biol.2015,4,5,554
–
558所述。
[0008]此外，根据生物催化反应发生的场所，又可以分为体外酶催化和胞内的发酵或转化。体外酶催化受限于酶的种类，例如目前色氨酸羟化酶都不能在体外大规模重构，只能使用L
‑
色氨酸合酶来合成，但5
‑
羟基吲哚的价格会提高这种方式生产的成本。
[0009]因此，目前生物法生成5
‑
羟色氨酸大部分是利用全细胞发酵或转化。在目前报道的5
‑
羟色氨酸生成产量上，多为4
‑
8g/L不等，如Metab Eng.2018Jul；48:279
‑
287.；Journal of Biological Engineering volume 12,Article number:3(2018)；CN107267417B，CN107164282B等。
[0010]导致全细胞(发酵)生成产物浓度较低的主要可能原因之一是较高浓度的胞内5
‑
HTP对代谢的干扰。细胞缺乏及时将产物转运出去，或维持胞内较低浓度5
‑
HTP的自发调节
机制。因此，找到一种主动转运5
‑
羟基色氨酸的策略，是提高5
‑
羟基色氨酸细胞转化(发酵)产量的重要研究方向。

技术实现思路

[0011]本专利技术针对现有技术的不足，本专利技术首次发现了一种具有转运5
‑
羟基色氨酸功能的转运蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；编码该转运蛋白的核苷酸，其序列如SEQ ID No.2所示：
[0012][0013]本专利技术提供一种转运蛋白，所述转运蛋白具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
[0014]本专利技术提供一种编码权利要求1所述的转运蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸具有如SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。
[0015]本专利技术提供一种载体，其特征在于，包含如上所述的多核苷酸。
[0016]优选的，所述载体是大肠杆菌表达质粒。
[0017]本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的转运蛋白和多核苷酸，或者包含如上所述的转运蛋白和载体。
[0018]优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。
[0019]本专利技术提供一种提高5
‑
羟基色氨酸微生物转化浓度的方法，所述方法在上述宿主细胞中过表达氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白。
[0020]优选的，所述方法以L
‑
色氨酸为底物，色氨酸
‑5‑
羟化酶为催化剂。
[0021]优选的，所述添加喋呤
‑
4α
‑
甲醇胺脱水酶和二氢单喋呤还原酶作为辅酶。
具体实施方式
[0022]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]实验材料
[0024]如无特别说明，本专利技术中使用的实验方法均为常规方法，基因克隆操作具体可参见前述Sambrook et al.,1989；Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)或其它分子生物实验手册。
[0025]i)试剂：DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)和T4连接酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自Axygen公司，5
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羟色胺、磷酸吡哆醛及L
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苯丙氨酸、L
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色氨酸、L
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羟色氨酸和L
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酪氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高5
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羟基色氨酸微生物转化浓度的方法，其特征在于，在宿主细胞中过表达氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法以L
‑
色氨酸为底物，色氨酸
‑5‑
羟...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢新开，徐伟，高迪，范俊英，
申请(专利权)人：湖南引航生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：