一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术公开的一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法，包括目的基因扩增；酶切、连接和转化；利用IPTG诱导目的基因的表达，经超声破碎获得蛋白粗酶液；采用Ni

【技术实现步骤摘要】
一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，更具体的说是涉及一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法。

技术介绍

[0002]养猪在中国占有巨大的市场份额，随着经济水平的发展，人们生活水平的提高，对肉类的需求量会逐步增加。养殖猪在中国的空间巨大，猪的饲料行业的总量会逐步增加。
[0003]乳猪由于身体没有发育完全，各种器官没有完全成熟，缺少乳糖酶。乳糖如果不被消化，会造成营养吸收不良，营养性腹泻。因此，在乳猪的饲料中添加乳糖酶，能促进营养吸收，避免营养腹泻等因素，提高乳猪养殖的效益。
[0004]由于非洲猪瘟的影响，在饲料的加工过程中，需要高温制粒或高温灭活病毒。高温加工饲料的过程当中，非耐热性的酶会失活，从而降低酶的性能。提高酶的稳定性，通常的方法有：酶固定化、酶化学修饰、酶的分子改造或酶分子融合等。酶的分子改造或酶分子融合被视为一种具有经济效益的途径。酶的分子改造相对于其它途径具有绿色、成本低、工业简单等优势。基于此，利用基因工程的方法，改造乳糖酶的耐热性，从而让其更适宜高温制粒或高温饲料的工艺，发挥最大的催化能力，降低乳猪饲养的成本。
[0005]因此，提供一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法，具体步骤如下：
[0009](1)目的基因扩增
[0010]以Primer
‑
F和Primer
‑
R为引物，以合成的乳糖酶基因序列SEQ ID NO.1为模板进行PCR扩增，获得目的基因；
[0011](2)酶切、连接和转化
[0012]将步骤(1)获得的目的基因和pRSFduet
‑
1表达载体分别进行双酶切，经连接，获得质粒pRSFduet
‑1‑
SQ，转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞；
[0013](3)利用IPTG诱导目的基因的表达，经超声破碎获得蛋白粗酶液；
[0014](4)采用Ni
‑
NTA纯化介质对蛋白粗酶液进行纯化，分析酶活性。
[0015]进一步，步骤(1)所述Primer
‑
F和Primer
‑
R的引物序列如下：
[0016]Primer
‑
F：5
’‑
GGGATCCATGTTCCCAGAAAA
‑3’
；SEQ ID NO.3；
[0017]Primer
‑
R：5
’‑
CGAATTCTTAGTGATGGTGGTG
‑3’
；SEQ ID NO.4。
[0018]进一步，步骤(2)所述双酶切所用的酶为BamH I和EcoR I。
[0019]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种乳猪高温教
槽料制备所需的乳糖酶的构建方法，利用定向进化技术，得到一个在较高的温度下具有更好的催化活性和热稳定性的乳糖酶，比酶活为141.3U/mg(pH 7.0，90℃)，在100℃半衰期为268.3min。该酶更适宜于高温制粒工艺或高温处理工艺，具有广阔的应用前景，巨大的潜在经济效益。
具体实施方式
[0020]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0021]E.coli DH5α，市售途径采购，实验室保藏；限制性内切酶，TakaRa公司；质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；即用型易错PCR试剂盒，北京天恩泽科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，福州奥研实验器材有限责任公司；质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；质粒pRSFduet
‑
1购自科雷生物科技有限公司；序列由擎科生物有限公司合成。
[0022]LB培养基：10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母浸粉。
[0023]洗涤缓冲液：10mM咪唑，50mM K2HPO4‑
KH2PO4，300mM NaCl，10％甘油，pH 8.0。
[0024]洗脱缓冲液：200mM咪唑，50mM K2HPO4‑
KH2PO4，300mM NaCl，10％甘油，pH 8.0。
[0025]保存缓冲液：50mM K2HPO4
‑
KH2PO4，300mM NaCl，10％甘油，pH 8.0。
[0026]实施例1易错PCR
[0027](1)目的基因扩增
[0028]以合成的Primer
‑
F和Primer
‑
R为引物，以合成的乳糖酶基因序列SEQ ID NO.1(包括限制性内切酶的酶切位点和终止子TAA以及His标签)为模板，进行易错PCR，获得目的基因。
[0029]GGGATCCATGTTCCCAGAAAAATTCCTGTGGGGTGTTGCACAGTCTGGCTTCCAGTTCGAAATGGGTGACAAACTGCGTCGTAACATCGACACCAACACCGATTGGTGGCATTGGGTTCGCGATAAAACGAACATTGAGAAAGGTCTGGTTTCTGGCGACCTGCCGGAAGAGGGCATTAACAACTACGAGCTGTACGAAAAAGACCACGAGATCGCACGTAAACTGGGTCTGAACGCGTATCGTATCGGTATTGAATGGTCCCGTATCTTCCCGTGGCCGACGACCTTCATTGACGTGGACTACAGCTACAACGAGTCCTATAACCTGATCGAAGACGTTAAAATTACCAAGGACACCCTGGAAGAACTGGATGAAATCGCAAACAAACGTGAAGTTGCTTATTATCGTAGCGTTATTAACTCCCTGCGCTCCAAAGGCTTCAAAGTTATTGTAAACCTGAACCACTTCACGCTGCCATACTGGCTGCACGACCCGATCGAAGCGCGTGAACGTGCACTGACCAACAAACGTAACGGCTGGGTGAACCCGCGCACGGTGATTGAGTTCGCTAAATATGCGGCCTACATCGCGTATAAATTCGGTGACATCGTAGACATGTGGAGCACCTTCAACGAACCGATGGTAGTTGTTGAACTGGGTTACCTGGCGCCGTACAGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳猪高温教槽料制备所需的乳糖酶的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)目的基因扩增以Primer
‑
F和Primer
‑
R为引物，以合成的乳糖酶基因序列SEQ ID NO.1为模板进行PCR扩增，获得目的基因；(2)酶切、连接和转化将步骤(1)获得的目的基因和pRSFduet
‑
1表达载体分别进行双酶切，经连接，获得质粒pRSFduet
‑1‑
SQ，转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞；(3)利用IPTG诱导目的基因的表达，经超声破碎获得蛋白粗酶液；(4)采用Ni
‑
NTA纯化介质对蛋白粗酶液进行纯化，分析酶活性。2.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：游锡火，王玉万，姜本荣，胡燕，梁大明，曾徐浩，夏胜，薛栋升，蒋慧，田美华，齐义清，沈力，
申请(专利权)人：中农华威生物制药湖北有限公司，
类型：发明
国别省市：