本发明专利技术中公开了一种重组表达载体，含有苯酚羟化酶基因，所述苯酚羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术同时提供含有上述重组表达载体的基因工程菌及该基因工程菌在降解苯酚中的应用。本发明专利技术从美棒状杆菌中克隆得到苯酚羟化酶基因，构建重组表达载体后，转化入大肠杆菌，表达得到苯酚羟化酶；测定其酶活为105.8U/ml，比活度达到了12.3U/mg，具有较高的酶活，可用于高效降解含酚废水，在工业废水处理中具有非常广泛的应用前景。废水处理中具有非常广泛的应用前景。废水处理中具有非常广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种重组表达载体、降解苯酚的基因工程菌及其应用
[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种重组表达载体、降解苯酚的 基因工程菌及其应用。
技术介绍
[0002]苯酚是一种具有高毒性和腐蚀性且难以被自然生态系统净化的有机污染 物，广泛存在于石油、化工、冶金、煤气等工业生产所排放的废水中。苯酚不 仅对人和动植物等有明显的毒害作用，而且不合理的排放还会导致生态环境的 污染。因此，它是我国及其他一些国家优先控制的污染物。
[0003]微生物法处理含酚废水具有处理效率高、能源消耗少、处理费用低、设备 投资较少、运行相对简单等优点。在受酚类化合物及其衍生物污染的环境中， 已经筛选并分离到多种能够降解苯酚的高效微生物菌种，通过对其降解性质、 降解条件、对苯酚的耐受性及降解效率进行研究，进而将其投入到废水处理系 统中，得到较好的处理效果。
[0004]微生物对苯酚的好氧降解过程是利用苯酚羟化酶将苯酚催化转化为邻苯二 酚，邻苯二酚通过两条不同的途径形成碳氢化合物，最终生成乙酰辅酶A、琥 珀酸、乙酸和丙酮酸等中间产物，进入三羧酸循环，为微生物的新陈代谢提供 所需要的能量。苯酚羟化酶的活性在微生物对苯酚的降解能力中起决定性作用。
[0005]如何保持降酚菌株的高降解活性、提高降解速率是生物法处理含酚废水的 主要问题。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的降酚菌株的苯酚羟化酶活性较 低，对苯酚的降解速率不高的问题，提供一种重组表达载体、降解苯酚的基因 工程菌及其应用。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种重组表达载体， 含有苯酚羟化酶基因，所述苯酚羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选地，扩增所述苯酚羟化酶基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
[0009]优选地，所述苯酚羟化酶基因来自美棒状杆菌(corynebacterium callunae)YZ01，所述美棒状杆菌YZ01保藏于武汉中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为：CCTCC NO:M2022554。
[0010]本专利技术同时提供一种降解苯酚的基因工程菌，该基因工程菌含有上述重组 表达载体。
[0011]优选地，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21。
[0012]本专利技术还提供上述基因工程菌在降解苯酚中的应用。
[0013]本专利技术所具有的有益效果：本专利技术从美棒状杆菌中克隆得到苯酚羟化酶基 因，构建重组表达载体后，转化入大肠杆菌，表达得到苯酚羟化酶；测定其酶 活为105.8U/ml，比
活度达到了12.3U/mg，具有较高的酶活，可用于高效降解 含酚废水，在工业废水处理中具有非常广泛的应用前景。
附图说明
[0014]图1为实施例1中PCR扩增得到的苯酚羟化酶基因片段的电泳图；
[0015]图2为实施例1中苯酚羟化酶基因成功插入表达载体的电泳验证图；
[0016]图3为实施例2中蛋白质电泳检测苯酚羟化酶的表达情况；
[0017]图4为实施例3中苯酚羟化酶酶活性测定图。
具体实施方式
[0018]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的说明。
[0019]pET
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32a质粒购自湖南丰晖生物科技有限公司；KpnI、EcoRI以及10
×
M buffer 均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR产物纯化及胶回收试剂盒购自北京 擎科生物有限公司；T4 DNA ligase以及10
×
T4 DNA ligase buffer均购自宝生物 工程(大连)有限公司；大肠杆菌感受态细胞BL21购自宝生物工程(大连)有 限公司；美棒状杆菌(corynebacterium callunae)YZ01筛选于绵阳某绝缘材料厂 的活性污泥中，分类命名为：Escherichia coli pheA1；于2022年05月03日保 藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉，武汉大学；保藏编 号为：CCTCC NO:M2022554。
[0020]实施例1构建重组表达载体
[0021]1、PCR扩增苯酚羟化酶基因
[0022]将美棒状杆菌YZ01中的苯酚羟化酶基因序列导入Primer 5软件设计引物， 引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。以美棒状杆菌YZ01的DNA为 模板，进行PCR扩增获得目的片段。PCR反应体系25ul：模板(总DNA)0.5 ul、上下游引物各0.5ul、2
×
PCRMix 12.5ul和ddH2O 11ul。PCR反应条件：95℃ 3min；95℃30s；55℃30s；72℃60s；循环数34；72℃5min。以1％琼脂糖凝 胶电泳验证并回收PCR扩增产物，扩增得到的片段与全基因组测序注释的基因 长度基本一致(附图1)，并将回收后的基因片段寄至北京擎科生物有限公司进 行测序，目的片段苯酚羟化酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0023]将测序返回结果与GeneBank数据库中的数据进行BLAST比对，结果表明 与基因相似度≥98％，可以确定克隆得到的基因片段为苯酚羟化酶基因。
[0024]2、重组质粒构建
[0025]用Kpn I和EcoR I限制性内切酶对目的基因片段及克隆表达载体pET
‑
32a 进行双酶切。将双酶切后的目的基因片段与克隆表达载体pET
‑
32a相连接，获得 重组表达载体。
[0026]目的基因的酶切体系(20ul)及条件为：ddH2O 6ul、目的基因片段10ul、 10
×
Mbuffer 2ul、KpnI 1ul、EcoRI 1ul；温度37℃，时间3h。克隆表达载体的酶 切体系(20ul)及条件为ddH2O 8ul、pET
‑
32a 8ul、10
×
M buffer 2ul、KpnI 1ul、 EcoRI 1ul；温度37℃，时间3h。
[0027]连接反应体系(10ul)及条件如下：目的基因片段7ul、pET
‑
32a载体1ul、 T4 DNAligase 1ul、10
×
T4 DNA ligase buffer 1ul；温度16℃、时间2h。
[0028]3、重组表达载体的验证
[0029]将上述构建的重组表达载体通过化学转化方法转入E.coli DH5α。
[0030]其具体步骤为：
[0031](1)在冰上融化E.coli DH5α感受态细胞，用移液枪吸取10ul连接产物加 入到感受态细胞中，用枪头轻柔搅拌均匀冰浴30min；
[0032](2)42℃热激细胞90s，不要摇动，轻移至冰浴2
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3min后加入900ulLB培 养基，37℃，220本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体，其特征在于，含有苯酚羟化酶基因，所述苯酚羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，扩增所述苯酚羟化酶基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述苯酚羟化酶基因来自美棒状杆菌(corynebacterium ca...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴生亮，张彤彤，叶子兰，赵莉，阮期平，
申请(专利权)人：绵阳晟氏健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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