病毒样颗粒质控检测品及其制备方法技术

本发明专利技术提供病毒样颗粒质控检测品及其制备方法，制备方法包括：获取目的基因CoV

【技术实现步骤摘要】
病毒样颗粒质控检测品及其制备方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体而言，涉及病毒样颗粒质控检测品及其制备方法。

技术介绍

[0002]运用实时荧光定量PCR（qPCR）技术进行核酸检测，快速、特异的识别病毒，仍然是阻断SARS
‑
CoV
‑
2传播、防控疫情的主要手段。但受样本的采集、运输和保存条件以及检测人员操作水平等因素的影响，核酸检测容易产生“假阴性”与“假阳性”问题。现有技术中为了解决假阳性问题，例如，有的试剂盒含有PCR反应酶及其RNA酶抑制剂， PCR反应液，柯萨奇病毒A16型正向引物序列，柯萨奇病毒A16型反向引物序列，柯萨奇病毒A16型探针序列，阴性质控检测品，阳性质控检测品，并利用实时荧光定量PCR技术，解决了检测实验在一段时间之后出现假阳性结果的技术问题。但是依旧存在核酸检测容易受到干扰的问题。
[0003]因此，必须在样品的检测中设置空白、阴性及阳性内参照RNA，以提高核酸检测的准确性。存在的问题是，RNA分子的稳定性差，极易被环境中的RNase降解，长期保存十分困难，容易对检测结果造成不良影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术解决了RNA分子的稳定性差，极易被环境中的RNase降解的技术问题，利用物理、化学或生物学手段包被RNA，避免其直接接触环境中的RNA酶，运用实时荧光定量PCR技术进行核酸检测，实现了提高RNA的稳定性，可为现有的新型冠状病毒核酸检测试剂盒提供安全、有效的阳性质控物质的技术效果。
[0005]为解决上述问题，本专利技术提供一种病毒样颗粒质控检测品的制备方法，包括以下步骤：S10：获取目的基因CoV
‑
N；S20：在目的基因CoV
‑
N的3
’
端下游加装MS2噬菌体的包装位点ACATGAGGATCACCCATGT，获得CoV
‑
N片段；S30：用限制性内切酶Nco
ꢀⅠ
和Hind
ꢀⅢ
对pCDFDuet
‑
1质粒进行双酶切，与MS2噬菌体的Mat
‑
CP片段以摩尔比1：2~10混合，获得重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP；S40：提取重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP，用Nde I内切酶和Avr II内切酶对重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP进行双酶切，与CoV
‑
N片段按照摩尔比1：2~10混合，获得重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP
‑
CoV
‑
N；S50：分离纯化重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP
‑
CoV
‑
N，并诱导表达，获得MS2病毒样颗粒质控检测品。
[0006]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术利用MS2噬菌体的包装特性，制备装载SARS
‑
CoV
‑
2 N基因RNA片段的MS2病毒样颗粒（MS2 PLPs），保护RNA分子，降低其被环境中的RNase降解的可能性，提高RNA的储存稳定性，用作SARS
‑
CoV
‑
2检测的内参照。将MS2噬菌体的外壳蛋白、成熟酶的编码序列与SARS
‑
CoV
‑
2 N基因的编码序列克隆重组到pCDFDuet
‑
1载体上，构建pCDF
‑
Mat
‑
CP
‑
CoV
‑
N重组质粒，转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞后，诱导衣壳蛋白、成熟酶以及SARS
‑
CoV
‑
2 N基因的表达，包装成为MS2 PLPs，操作简便有效。采用大肠杆菌双表达质粒，在细胞内拷贝数多，使得外源基因能够大量扩增，同
时表达两个外源基因，并且分两步构建重组质粒，能够提升重组质粒的准确度确保序列无误。
[0007]在本专利技术的一个实例中，S30还包括以下步骤：S31：优化并标记Mat
‑
CP片段。
[0008]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：根据Genbank中MS2噬菌体的衣壳蛋白（CP）和成熟酶（Mat）基因的编码序列，根据大肠杆菌的偏爱密码子对序列进行优化，并插入组氨酸标签（His
‑
tag），能够方便后续纯化。
[0009]在本专利技术的一个实例中，标记Mat
‑
CP片段包括以下步骤：S22：在MS2噬菌体的Mat
‑
CP序列上游添加His
‑
tag。
[0010]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：在Mat
‑
CP序列上游添加了His
‑
tag，以便后续用镍离子亲和层析柱纯化MS2 PLPs。
[0011]在本专利技术的一个实例中，S22之后包括以下步骤：S23：在His
‑
tag与上下游的CP序列之间分别添加GGGGS编码序列。
[0012]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：为了提高衣壳蛋白的包装效率，在His
‑
tag与上下游的衣壳蛋白编码序列之间分别添加了一个GGGGS编码序列，以增加肽链的柔性，提高包装效率。
[0013]在本专利技术的一个实例中，GGGGS编码序列数量为1
‑
8个。
[0014]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：GGGGS序列可以有1
‑
8个拷贝，均能达到增加肽链的柔性，提高包装效率的效果。
[0015]在本专利技术的一个实例中，制备方法还包括以下步骤：S60：纯化MS2病毒样颗粒质控检测品。
[0016]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：得到的纯化MS2 PLPs样品能够用于后续指标的测定，以及用作SARS
‑
CoV
‑
2检测。
[0017]在本专利技术的一个实例中，Mat
‑
CP片段的碱基序列如SEQID No：1所示。
[0018]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：在His
‑
tag与上下游的衣壳蛋白编码序列之间分别添加了四个GGGGS编码序列，得到Maturase
‑
CP
‑
G4S
‑
His
‑
G4S
‑
CP序列，能够大大增加肽链的柔性，提高包装效率。
[0019]本专利技术还提供一种病毒样颗粒质控检测品，病毒样颗粒质控检测品采用上述任一种制备方法获得，病毒样颗粒质控检测品用作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种病毒样颗粒质控检测品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S10：获取目的基因CoV
‑
N；S20：在所述目的基因CoV
‑
N的3
’
端下游加装MS2噬菌体的包装位点ACATGAGGATCACCCATGT，获得CoV
‑
N片段；S30：用限制性内切酶Nco
ꢀⅠ
和Hind
ꢀⅢ
对pCDFDuet
‑
1质粒进行双酶切，与所述MS2噬菌体的Mat
‑
CP片段以摩尔比1:2~10混合，获得重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP；S40：提取所述重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP，用Nde I内切酶和Avr II内切酶对所述重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP进行双酶切，与所述CoV
‑
N片段按照摩尔比1：2~10混合，获得重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP
‑
CoV
‑
N；S50：分离纯化所述重组质粒pCDF
‑
Mat
‑
CP
‑
CoV
‑
N，并诱导表达，获得MS2病毒样颗粒质控检测品。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S30还包括以下步骤：S31：优化并标记所述Mat
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CP片段。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述标记所述Mat
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【专利技术属性】
技术研发人员：齐莉莉，王进波，张正，曾县平，
申请(专利权)人：浙大宁波理工学院，
类型：发明
国别省市：