一种猪β-防御素129蛋白及其多克隆抗体的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种猪β

【技术实现步骤摘要】
一种猪
β
‑
防御素129蛋白及其多克隆抗体的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和基因工程
，具体为一种猪β
‑
防御素129蛋白及其多克隆抗体的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]种公猪对猪群繁殖性能有巨大影响。提高种公猪繁殖力是当今畜牧业中突出的核心问题，公猪的繁殖性能取决于其精子的受精能力，而精液中的蛋白成分决定了精子受精能力的高低。精液蛋白作为受精能力标志因素，影响着精子生殖生理过程。精液蛋白作为精子冷冻保存、精液保护和人工授精等精子生物技术提供新思路。探索精清蛋白对公猪精子受精能力的影响及机制，为选育高繁品系种公猪提供便捷方法。
[0003]猪β防御素129(Porcine beta
‑
Defensins；PBD129)，是近年来在生殖器官中新发现的猪β
‑
防御素，并且在附睾中高表达。有研究证明PBD129可以抑制肠道炎症来减轻大肠杆菌攻击诱导的感染，表现出免疫调节分子的强大功能和炎症激活。而且在牛中β
‑
防御素129参与了免疫反应和精子成熟，抑制精子表面的β
‑
防御素129蛋白后降低胚胎卵裂率、桑葚胚和囊胚形成率。基于这些结果提示PBD129蛋白可能影响受精和胚胎的形成。但是PBD129蛋白的表达模式和生物学功能仍不清楚。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种猪β
‑
防御素129 蛋白的制备方法。
[0005]本专利技术的另一目的在于，提供一种猪β
‑
防御素129蛋白的多克隆抗体的制备方法。
[0006]本专利技术的另一目的在于，提供上述蛋白及其多克隆抗体的应用。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种猪β
‑
防御素129蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0009](1)将PBD129基因与pMD18
‑
T载体连接后得到PBD129
‑
18T重组质粒，并转化感受态细胞；
[0010](2)从步骤(1)中制备得到的感受态细胞中提取克隆质粒，酶切后得到 PBD129片段，回收后与线性化的pET
‑
28a载体连接，得到pET
‑
28a
‑
PBD129重组质粒，并转化工程菌；
[0011](3)将步骤(2)中得到的工程菌进行诱导培养，之后离心、裂解、分离得到猪β
‑
防御素129蛋白。
[0012]步骤(1)中所述的感受态细胞为DH5α感受态细胞。
[0013]步骤(2)中所述的工程菌为BL21表达菌。
[0014]步骤(3)中所述的诱导培养的培养基为含有卡那霉素的LB液体培养基。
[0015]步骤(3)中所述的诱导培养的条件为35～39℃下培养15～20h，优选为37℃下培养18h。
[0016]步骤(3)中所述的诱导培养的诱导剂为IPTG，优选为终浓度为1mmol/L 的IPTG。
[0017]步骤(3)中所述的离心的条件为2000～4000rpm下离心10～20min，优选为3000rpm下离心15min。
[0018]步骤(3)中所述的裂解的条件为超声破碎仪破碎菌体。
[0019]步骤(3)中所述的分离的条件为在3～5℃、10000～15000rpm条件下离心 8～12min，优选为4℃、12000rpm条件下离心10min。
[0020]一种猪β
‑
防御素129蛋白多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0021]S1.取猪β
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防御素129蛋白与佐剂混合，对实验动物进行初次免疫；
[0022]S2.初次免疫15天后，取猪β
‑
防御素129蛋白与佐剂混合，对实验动物进行第二次免疫；
[0023]S3.第二次免疫15天后，取猪β
‑
防御素129蛋白与佐剂混合，对实验动物进行第三次免疫；
[0024]S4.第三次免疫7天后，采集实验动物全血，分离血清得到抗血清；
[0025]S5.对抗血清进行纯化，得到猪β
‑
防御素129蛋白多克隆抗体。
[0026]步骤S1中所述的佐剂为弗氏完全佐剂。
[0027]步骤S2中所述的佐剂为弗氏不完全佐剂。
[0028]步骤S3中所述的佐剂为弗氏不完全佐剂。
[0029]所述的猪β
‑
防御素129蛋白与弗氏完全佐剂混合后，猪β
‑
防御素129蛋白的浓度为0.8～1.2μg/μL，优选为1μg/μL。
[0030]所述的混合为充分乳化。
[0031]步骤S4中所述的纯化为使用层析柱纯化，优选为使用Protein A/G
‑
Sepharose 层析柱纯化。
[0032]所述的猪β
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防御素129蛋白在制备多克隆抗体中的应用。
[0033]一种猪β
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防御素129蛋白多克隆抗体，通过上述制备方法制备得到。
[0034]所述的猪β
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防御素129蛋白多克隆抗体在选育高繁品系种公猪中的应用。
[0035]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0036]针对现有技术中存在的难以表达猪PBD129蛋白表达的问题，本专利技术设计了一种猪PBD129蛋白的原核表达纯化与多克隆抗体制备的研究方法。通过本方法确定了：
[0037](1)PBD129蛋白在PET
‑
28a载体且在37℃、IPTG浓度1.0mM、诱导18h 的条件下获得表达，该方法易于大量制备，操作简单；
[0038](2)确定了PBD129重组蛋白以可溶性及包涵体表达并在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的胶图上可以观察到单一的目标蛋白条带；
[0039](3)制备的PBD129多克隆抗体具有特异性；本方法为日后研究猪PBD129 蛋白在生殖中的作用机制和蛋白功能的领域提供原始材料以及科研数据。
附图说明
[0040]图1是猪β
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防御素129蛋白及其多克隆抗体的制备步骤示意图。
[0041]图2是重组菌BL21
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pET
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28a
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PBD129的SDS
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PAGE鉴定结果图，其中M泳道为marker；1号泳道为重组菌未诱导前；2号泳道为重组菌经IPTG诱导后。
[0042]图3是重组菌BL21
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pET
‑
28a
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PBD129的菌液蛋白Western blot鉴定结果图，其中M
泳道为marker；1号泳道为重组菌诱导后细菌裂解本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪β
‑
防御素129蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将PBD129基因与pMD18
‑
T载体连接后得到PBD129
‑
18T重组质粒，并转化感受态细胞；(2)从步骤(1)中制备得到的感受态细胞中提取克隆质粒，酶切后得到PBD129片段，回收后与线性化的pET
‑
28a载体连接，得到pET
‑
28a
‑
PBD129重组质粒，并转化工程菌；(3)将步骤(2)中得到的工程菌进行诱导培养，之后离心、裂解、分离得到猪β
‑
防御素129蛋白。2.根据权利要求1所述的猪β
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防御素129蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的感受态细胞为DH5α感受态细胞；步骤(2)中所述的工程菌为BL21表达菌；步骤(3)中所述的诱导培养的培养基为含有卡那霉素的LB液体培养基。3.根据权利要求1所述的猪β
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防御素129蛋白的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的诱导培养的条件为35～39℃下培养15～20h；步骤(3)中所述的诱导培养的诱导剂为IPTG；步骤(3)中所述的离心的条件为2000～4000rpm下离心10～20min；步骤(3)中所述的裂解的条件为超声破碎仪破碎菌体；步骤(3)中所述的分离的条件为在3～5℃、10000～15000rpm条件下离心8～12min。4.一种猪β
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防御素129蛋白多克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：S1.取猪β

【专利技术属性】
技术研发人员：张守全，曾繁文，卫恒习，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：