一种重组载体质粒、水杨酸生物传感器及构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种重组载体质粒、水杨酸生物传感器及构建方法和应用。该载体质粒包括改造的NahR蛋白的编码基因、Pr启动子、报告标记蛋白的编码基因、改造的Psal启动子及质粒骨架；Pr启动子和改造的Psal启动子方向相反；改造的NahR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；改造的Psal启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。改造的Psal启动子与野生型相比，具有更强的感应效果。改造的NahR蛋白进一步提高生物传感器对水杨酸的响应灵敏度。该生物传感器，对水杨酸的相应灵敏度更高，降低了对水杨酸的检出限。降低了对水杨酸的检出限。降低了对水杨酸的检出限。

A recombinant vector plasmid and salicylic acid biosensor and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种重组载体质粒、水杨酸生物传感器及构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体而言，涉及一种重组载体质粒、水杨酸生物传感器及构建方法和应用。

技术介绍

[0002]水杨酸作为多环芳烃(PAHs)代谢的中间产物，在多环芳烃的检测上具有重要的意义。多环芳烃是一类持久性有机污染物，广泛存在于环境中，具有半挥发性、生物累积性和环境持久性；同时具有致癌、致突变和致畸作用。目前常用的多环芳烃检测方法有着各种各样的不足，因此寻找一种简单快速、高效灵敏的方法迫在眉睫。
[0003]全细胞生物传感器已成为环境污染物监测分子工具中最新领域之一。由于微生物的低成本以及合适的pH和温度范围，已被广泛用作生物传感器的构造中的生物传感元件。全细胞生物传感器通过将应答启动子与报告基因进行组合，得到易被识别的信号。其中调控蛋白或启动子需要能够对待检测物的浓度变化做出响应，然后将信号转换成易于检测的报告蛋白信号。与环境污染物传统的化学和电子检测方法相比，全细胞微生物传感器具有成本低、体积小、可降解、分析速度快、可在线或原位分析等优点，在生物制造过程监控、环境监测与食品安全、医疗诊断与监护等领域有极高的应用价值。
[0004]Pseudomonas putida G7是目前研究最为广泛的PAHs降解菌株之一，多环芳烃经该菌株中上游基因簇可被氧化开环得到中间产物水杨酸，而NahR可将水杨酸作为该调控蛋白的效应物，通过易于被检测的报告基因得到信号，从而间接实现对PAHs的检测。
[0005]但是目前生物传感法对多坏芳烃的检测在其敏感度方面性能不佳，仍未实现实际应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种重组载体质粒、水杨酸生物传感器及构建方法和应用。
[0007]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供一种水杨酸生物传感器的重组载体质粒，包括改造的NahR蛋白的编码基因、Pr启动子、报告标记蛋白的编码基因、改造的Psal启动子及质粒骨架；所述Pr启动子和所述改造的Psal启动子方向相反；所述改造的NahR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述改造的Psal启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0009]进一步，所述Pr启动子和所述改造的Psal启动子的
‑
35区核苷酸序列重叠。
[0010]进一步，所述报告标记蛋白为绿色荧光蛋白eGFP，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0011]进一步，所述质粒骨架为大肠杆菌高拷贝载体pUC57。
[0012]本专利技术提供一种水杨酸生物传感器，包括宿主细胞及位于所述宿主细胞内的如上述的重组载体质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0013]进一步，所述大肠杆菌为E.coli DH5α。
[0014]本专利技术提供一种如上述的水杨酸生物传感器的构建方法，包括以下步骤：
[0015]先构建含有野生型NahR蛋白的编码基因及野生型Psal启动子的载体，再分别对所述野生型NahR蛋白的编码基因及所述野生型Psal启动子进行改造，得到含有所述改造的NahR蛋白的编码基因和所述改造的Psal启动子的重组质粒载体；最后将所述重组质粒载体转入宿主细胞，得到所述水杨酸生物传感器。
[0016]进一步，所述野生型Psal启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述野生型NahR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1。
[0017]本专利技术提供如上述的水杨酸生物传感器在检测水杨酸中的应用。
[0018]本专利技术提供一种水杨酸的检测方法，采用上述的水杨酸生物传感器进行检测。
[0019]本专利技术的有益效果在于：
[0020](1)本专利技术的水杨酸生物传感器的重组载体质粒，含有改造的Psal启动子；改造的Psal启动子的
‑
35区由TTATCAA变成TTGTCA；
‑
10区由TATCGT变成TATAAT，与野生型的Psal启动子相比，具有更强的感应效果。
[0021](2)本专利技术的水杨酸生物传感器的重组载体质粒，含有改造的NahR蛋白的编码基因，该编码基因编码的改造的NahR蛋白，169位点由谷氨酸变成甘氨酸，248位点由半胱氨酸变为苏氨酸，进一步提高了生物传感器对水杨酸的响应灵敏度。
[0022](3)本专利技术水杨酸生物传感器，与传统的生物传感器相比，对水杨酸的相应灵敏度更高，降低了对水杨酸的检出限。
[0023](4)本专利技术的水杨酸检测方法，采用本专利技术的水杨酸生物传感器进行检测，具有快速、便捷、准确、灵敏性高的优点。
附图说明
[0024]图1为本专利技术的水杨酸生物传感器的结构示意图；
[0025]图2为本专利技术的水杨酸生物传感器中，实施例2的突变体W10与野生型菌体在不同浓度的水杨酸的相对荧光强度；其中，横坐标为水杨酸的浓度，纵坐标为荧光强度和OD
600
的比值；
[0026]图3为本专利技术的水杨酸生物传感器中，实施例3的突变体E169GC248T与仅含有改造的Psal启动子的菌体在不同浓度的水杨酸的相对荧光强度；其中，横坐标为水杨酸的浓度，纵坐标为荧光强度和OD
600
的比值。
具体实施方式
[0027]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0028]本专利技术的水杨酸生物传感器的重组载体质粒，包括改造的NahR蛋白的编码基因、Pr启动子、报告标记蛋白的编码基因、改造的Psal启动子及质粒骨架；Pr启动子和改造的Psal启动子方向相反；改造的Psal启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，改造的NahR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0029]SEQ ID No.5：
[0030]tatttgtcaatattgtttgctccgttataattattaacaagtcatcaataaagccatcacgagtaccatag
[0031]SEQ ID No.6:
[0032]MELRDLDLNLLVVFNQLLVDRRVSITAENLGLTQPAVSNALKRLRTSLQDPLFVRTHQGMEPTPYAAHLAEPVTSAMHALRNALQHHESFDPLTSERTFTLAMTDIGEIYFMPRLMDVLAHQAPNCVISTVRDSSMSLMQALQNGTVDLAVGLLPNLQTGFFQRRLLQGHYVCLCRKDHPVTREPLTLERFCSYGHVRVIAAGTGHGEVDTYMTRVGIRRDIRLEVPHFAAVGHILQRTDLLATVPITLADCCVEPFGLSALPHPVVLPEIAINMFWHAKYHKDLANIWLRQLMFDLFTD*。
[0033]本专利技术的上述重组载体质粒中，改造的Psal启动子和改造的NahR蛋白对水杨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水杨酸生物传感器的重组载体质粒，其特征在于，包括改造的NahR蛋白的编码基因、Pr启动子、报告标记蛋白的编码基因、改造的Psal启动子及质粒骨架；所述Pr启动子和所述改造的Psal启动子方向相反；所述改造的NahR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述改造的Psal启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。2.根据权利要求1所述一种水杨酸生物传感器的重组载体质粒，其特征在于，所述所述Pr启动子和所述改造的Psal启动子的
‑
35区核苷酸序列重叠。3.根据权利要求1所述一种水杨酸生物传感器的重组载体质粒，其特征在于，所述报告标记蛋白为绿色荧光蛋白eGFP，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。4.根据权利要求1所述一种水杨酸生物传感器的重组载体质粒，其特征在于，所述质粒骨架为大肠杆菌高拷贝载体pUC57。5.一种水杨酸生物传感器，其特征在于，包括宿主细胞及位于所述宿主细胞内的如权利要求1～4任意一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张桂敏，魏沁，贺妮莎，杨沫，卢争辉，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：