重组胱硫醚β-裂解酶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组胱硫醚β

Recombinant cystathionide \u03b2- Preparation and application of lyase

【技术实现步骤摘要】
重组胱硫醚
β
‑
裂解酶的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及重组胱硫醚β
‑
裂解酶的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]CBL(胱硫醚β
‑
裂解酶)是一种磷酸吡哆醛依赖的酶，是蛋氨酸生物合成途径中的关键酶，能够催化胱硫醚裂解产生同型半胱氨酸(Hcy)、丙酮酸和氨。血浆中Hcy的测定已经成为心脑血管等疾病的早期诊断常见方法。
[0003]目前，Hcy主要的检测方法之一是酶循环法，该法操作简便，检测速度快，准确度高。酶循环法的原理是通过胱硫醚β
‑
合成酶(Cystathioninβ
‑
synthetase， CBS)催化L
‑
丝氨酸(L
‑
Ser)和Hcy形成L
‑
胱硫醚(L
‑
Cystathionine，L
‑
Cth)，而L
‑
Cth又能在胱硫醚β
‑
裂解酶(Cystathionineβ
‑
lyase，CBL)的催化作用下，形成Hcy、丙酮酸和氨。因此，CBS和CBL的品质是影响酶循环法测定Hcy效果的关键。
[0004]现有技术中已有一些采用基因工程的手段，制备重组胱硫醚β
‑
裂解酶的方案，但一方面的蛋白的表达量较低，且所得蛋白的纯度、活性有限，不能很好的用于HCY循环酶法试剂盒的制备。
专利技术内容
[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供高表达量、高纯度、高活性的重组胱硫醚β
‑
裂解酶的制备方法及其应用。
[0006]本专利技术提供的表达胱硫醚β
‑
裂解酶的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，其来自大肠杆菌。
[0007]本专利技术提供了胱硫醚β
‑
裂解酶的表达载体，其以pET
‑
28a(+)为骨架载体，其中含有SEQ ID NO:1所示序列的核酸。
[0008]在本专利技术所述的表达载体中SEQ ID NO:1所示序列的核酸的插入位点为BamHI和NotI。
[0009]本专利技术提供的表达载体表达SEQ ID NO:1所示序列后，形成的蛋白为融合蛋白，其在胱硫醚β
‑
裂解酶的N端添加6
×
His标签，以及T7检测标记。
[0010]本专利技术还提供了一种重组大肠杆菌，其为转化本专利技术所述的质粒载体的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
[0011]本专利技术以E.coliBL21作为表达的宿主细胞，在培养后获得的蛋白表达量较高、纯度较高，从而获得了良好的回收率。并且，在表达过程中，折叠正确，形成了正确的二级结构以及三级结构，从而维持了胱硫醚β
‑
裂解酶的生物活性，使其能够用于制备HCY循环酶法检测试剂盒。
[0012]本专利技术还提供了胱硫醚β
‑
裂解酶的制备方法，其包括：诱导培养本专利技术所述的重组大肠杆菌，诱导蛋白表达后，收集菌体经纯化获得胱硫醚β
‑
裂解酶。
[0013]本专利技术中，所述诱导培养包括，扩大培养和诱导表达的步骤。
[0014]本专利技术中，所述诱导培养的培养基为TB培养基；所述诱导的诱导剂为 IPTG。其中所述扩大培养是指将构建获得重组大肠杆菌接种至TB培养基，于37℃、220rpm条件下培养至OD
600
值∽1。所述诱导表达的培养基为TB培养基，诱导剂的剂量为1mmol/L，37℃，220rpm诱导8h。
[0015]本专利技术中，所述TB培养基包括水和：11.8g/L胰蛋白胨、23.6g/L酵母提取物、9.4g/LK2HPO4、2.2g/LKH2PO4、4ml/L甘油。
[0016]在本专利技术中，所述纯化包括：
[0017]超声破碎菌体后，离心取上清液；所述上清液过镍琼脂糖凝胶柱，以清洗缓冲液清洗然后用洗脱缓冲液洗脱；
[0018]所述清洗缓冲液包括水和20mmol/L Tris
‑
HCl，250mmol/L NaCl，50 mmol/LImidazole，100μmol/LPLP；
[0019]所述洗脱缓冲液包括水和20mmol/L Tris
‑
HCl，250mmol/L NaCl，250 mmol/LImidazole，100μmol/LPLP。
[0020]本专利技术中，所述超声破碎前，以平衡缓冲液重悬菌体；所述重悬至重悬液中菌体浓度为0.05g/mL；所述平衡缓冲液包括水和20mmol/L Tris
‑
HCl， 250mmol/LNaCl，25mmol/LImidazole，100μmol/LPLP。
[0021]在本专利技术中，所述超声破碎的条件包括：
‑
4～4℃，25％功率，工作3s停 3s。具体的，所述超声破碎采用冰浴破碎。
[0022]本专利技术所述制备方法制得的胱硫醚β
‑
裂解酶。
[0023]本专利技术还提供了HCY循环酶法检测试剂盒，其包括试剂A和试剂B；
[0024]所述试剂A包括水和500mmol/L L
‑
Ser、70mmol/L NADH、2％BSA和 50mmol/LTris
‑
HCl；
[0025]所述试剂B包括水和5U/mg CBS、60U/mg CBL、5U/μL LDH、2％BSA、 50mmol/LTris
‑
HCl和100μmol/LPLP；
[0026]其中，CBL为本专利技术所述制备方法制得的胱硫醚β
‑
裂解酶。
[0027]本专利技术还提供了HCY的循环酶检测方法，其以本专利技术提供的试剂盒进行检测。
[0028]本专利技术通过分子克隆技术扩增大肠杆菌胱硫醚β
‑
裂解酶的目的基因，并将其与质粒pET
‑
28a(+)连接，并转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中，并成功获得表达菌株Eoli BL21(DE3)(PET28a
‑
CBL)，经过IPTG诱导，可使 CBL重组蛋白表达，经过His
‑
tag进行镍亲和层析获得纯度高活性好的CBL 重组蛋白，并将其应用于HCY循环酶法试剂盒的开发。实验表明，本专利技术提供的制备方法可溶性表达量达到350mg/L，试剂盒的准确率、精密度皆良好。
附图说明
[0029]图1示CBL纯化前后全过程；
[0030]图2示以本专利技术实施例1制备的重组CBL检测HCY，具有良好的线性关系。
具体实施方式
[0031]本专利技术提供了重组胱硫醚β
‑
裂解酶的制备方法及其应用，本领域技术人员可以借
鉴本文内容，适当改进工艺参数实现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.胱硫醚β
‑
裂解酶的表达载体，其特征在于，以pET
‑
28a(+)为骨架载体，其中含有SEQ ID NO:1所示序列的核酸。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，SEQ ID NO:1所示序列的核酸的插入位点为BamHI和NotI。3.重组大肠杆菌，其特征在于，为转化权利要求1或2所述的质粒载体的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。4.胱硫醚β
‑
裂解酶的制备方法，其特征在于，包括：诱导培养权利要求3所述的重组大肠杆菌，收集菌体经纯化获得胱硫醚β
‑
裂解酶。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述诱导培养的培养基为TB培养基；所述诱导的诱导剂为IPTG，诱导剂的剂量为1mmol/L。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括：超声破碎菌体后，离心取上清液；所述上清液过镍琼脂糖凝胶柱，以清洗缓冲液清洗然后用洗脱缓冲液洗脱；所述清洗缓冲液包括水和20mmol/L Tris
‑
HCl，250mmol/L NaCl，50mmol/L Imidazole，100μmol/L PLP；所述洗脱缓冲液包括水和20mmol/L Tris
‑
HCl，250mmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宗祥，张蕊，罗继全，
申请(专利权)人：三诺生物传感股份有限公司，
类型：发明
国别省市：