一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表面展示生物酶的无载体双固定化高效生物催化剂及其制备方法和应用，属于生物化工和发酵工程技术领域。本申请利用细胞表面展示技术将酶固定在宿主细胞表面，利用细胞表达絮凝蛋白实现细胞成团，从而固定在反应器中，絮凝细胞颗粒自重沉降，无需离心操作，可实现产物分离和催化剂连续循环使用，简化生产环节，增加生产强度，降低生产成本；此外固定化细胞密度大，形成细胞群体效应，进一步提高环境胁迫耐受性，降低产物浓度抑制压力，广泛适用于各类高附加价值化学品的规模化绿色生物制造。本发明专利技术所述的生物催化剂的制备方法为我国开发具有完全自主知识产权的生物催化剂和化学品的绿色生物制造奠定良好的基础。基础。基础。

A supportless double immobilized biocatalyst with biological enzyme on its surface and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物化工和发酵工程
，具体涉及一种无载体双固定化生物催化剂的开发与优化，及其在生物催化转化和产物分离纯化过程的应用。

技术介绍

[0002]作为世界第一制造大国，化工产业是我国国民经济和国防工业重要的基础性行业。但是当前经济社会发展面临诸多挑战，如与日俱增的能源需求，日益枯竭的土地、水和化石资源，和逐渐加剧的全球变暖等。因此，开发绿色可持续的制造模式是我国化工产业发展的必然趋势。
[0003]近年来，生物制造技术的不断进步为传统化工产业的转型升级提供了绿色动力，也成为了未来我国实现绿色发展的重要突破口。生物制造技术不仅能节约资源(把高温、高压、高污染的化学工业过程向着条件温和、清洁环保的生物加工过程转移)，而且在碳减排方面也做出了突出贡献(工业过程中每使用1kg酶制剂，可显著减少100kg二氧化碳的排放)，因而被全球众多国家积极的推进和发展，广泛地应用于农业、工业、食品、保健品和医药等领域。
[0004]我国生物制造技术起步较晚，目前虽发展迅速，但仍存在不少技术短板和“卡脖子”问题，尤其是缺乏具有完全自主知识产权的生物制造核心“芯片”：生物催化剂。面对美国、日本、荷兰等国的技术垄断，我国生物制造产业正处于技术攻坚克难和商业开拓应用的关键阶段，迫切需要高效且优质的生物催化剂以及绿色化与集成化的生产过程。
[0005]现有的生物催化剂主要分为两类，酶制剂和微生物全细胞催化剂。其中，酶制剂催化活性高，但存在酶制备步骤多、难度大、易失活且难以回收再利用、下游产物分离纯化困难以及生产成本高等缺点。工业生产过程一般会采用酶的固定化来提高酶利用率，不过传统固定化方法也存在影响催化效率的传质阻力问题(专利CN104480075A和CN105274174A)。而含有生物酶的全细胞催化剂有效克服了酶制剂的使用弊端，但产物易被胞内酶降解、跨膜阻力影响生产效率、以及分离纯化过程中需要使用大型离心设备和巨大能耗等仍是不容忽视的问题(专利CN201611254213.2)。因此，围绕国家重大战略需求，加快关键核心技术攻关，本领域现急需开发一种能够广泛应用于不同底物的通用性生物催化平台技术以规模化创制各种高效且优质的生物催化剂，并设计具有高活性、高强度、低成本和可持续特色的生产方式实现高附加价值化学品的绿色生物制造，使之具备与化学法相竞争的潜力开拓占领国内外市场份额，积极推动工业绿色化和产业国际化。

技术实现思路

[0006]鉴于此，本专利技术首次建立了一种表面展示生物酶的无载体双固定化高效生物催化剂及其制备方法和应用。
[0007]本专利技术的目的之一是通过引导肽将一种或多种生物酶锚定到细胞表面，实现生物
酶在细胞的原位固定化，避免物质运输的跨膜阻力和产物的胞内降解。
[0008]本专利技术的目的之二是通过絮凝基因的表达使细胞自絮凝成毫米级颗粒，实现生物反应器内固液自动化分离的无载体固定化，自重沉降分离产物和生物催化剂，避免离心和传质阻力。
[0009]本专利技术的目的之三是开发基于上述目的表面展示生物酶的无载体双固定化通用性平台技术，以规模化创制高效且优质的生物催化剂，实现多种高附加值化学品的生物制造。
[0010]本专利技术的目的之四是开发清洁、安全、高效和连续的生产工艺，通过生物催化剂循环利用简化生产环节，降低生产成本，提高生产强度，实现多种高附加值化合物的绿色可持续化生产。
[0011]本专利技术的目的之五是提供一种创制高效优质生物催化剂、重构与强化反应与分离过程、实现产物连续高强度生产的全链条工艺设计。
[0012]本专利技术的目的之六是提供一种改变絮凝性状的方法，实现絮凝颗粒尺寸的可控调节，使之无载体自固定化于生物反应器。
[0013]本专利技术的目的之七是提供一种酶活高、稳定性好、无载体、可循环使用、无跨膜阻力和传质阻力的酶与细胞的双固定化方法。
[0014]本申请的具体技术方案如下：
[0015]一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂的制备方法，首先克隆絮凝基因并优化絮凝基因结构以调整宿主细胞的絮凝颗粒尺寸，实现宿主细胞的无载体自固定化，然后通过表面展示技术将生物酶固定化于宿主细胞的外表面，所得宿主细胞经过培养后即得表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂。
[0016]基于以上技术方案，进一步地，所述的制备方法主要包括以下步骤：
[0017](1)首先分别扩增启动子和絮凝基因，插入到载体中构建絮凝表达载体，优化絮凝基因结构，制备絮凝基因重复序列随机丢失的突变文库，转入宿主细胞中筛选阳性转化子，筛选具有絮凝性状的宿主细胞；
[0018](2)扩增获得生物酶的基因，连接到表面展示表达载体中，将所得的表面展示表达载体转入步骤(1)得到的宿主细胞中，经过培养后得到表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂。
[0019]基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的絮凝基因包括但不局限于FLO1，FLO5，FLO9，FLO10，FLO11基因；所述的启动子包括但不局限于PGK和GAL1(SEQ ID NO.2)；组成型强表达启动子PGK使得絮凝基因从生长开始就表现出絮凝状态；半乳糖诱导型启动子GAL1，受葡萄糖抑制，在葡萄糖耗尽时半乳糖可启动外源基因表达，使宿主细胞成为絮凝状态。
[0020]基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的表达载体为穿梭载体、游离载体和整合载体中的任意一种，包括但不局限于pRS425。
[0021]基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述宿主细胞为原核微生物和真核微生物中的任意一种，包括但不局限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、微藻类。
[0022]基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述的宿主细胞为真核微生物的任意一
种，包括但不局限于酿酒酵母S.cerevisiae EBY100。
[0023]基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)中所述优化具体过程为：将构建的絮凝表达载体转入大肠杆菌Escherichia coli DH5α中培养，混菌提质粒，获得絮凝基因重复序列随机丢失的突变文库。
[0024]基于以上技术方案，进一步地，步骤(2)中所述生物酶的种类为一种或两种以上，所述生物酶为水解酶、转酯酶或合成酶，包括但不局限于Asp
‑
OMe
‑
Phe合成的转酯酶和烟酰胺单核苷酸合成的烟酰胺核糖激酶。
[0025]基于以上技术方案，进一步地，Asp
‑
OMe
‑
Phe合成的转酯酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，烟酰胺单核苷酸合成的烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0026]基于以上技术方案，进一步地，步骤(2)中所述的表面展示表达载体的表面展示方法包括但不局限于絮凝素锚定和SED锚定。
[0027]基于以上技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂的制备方法，其特征在于，首先克隆絮凝基因并优化絮凝基因结构以调整宿主细胞的絮凝颗粒尺寸，实现宿主细胞的无载体自固定化，然后通过表面展示技术将生物酶固定化于宿主细胞的外表面，所得宿主细胞经过培养后即得表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法主要包括以下步骤：(1)首先分别扩增启动子和絮凝基因，插入到载体中构建絮凝表达载体，优化絮凝基因结构，制备絮凝基因重复序列随机丢失的突变文库，转入宿主细胞中筛选阳性转化子，筛选具有絮凝性状的宿主细胞；(2)扩增获得生物酶的基因，连接到表面展示表达载体中，将所得的表面展示表达载体转入步骤(1)得到的宿主细胞中，经过培养后得到表面展示生物酶的无载体双固定化生物催化剂。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的絮凝基因包括但不局限于FLO1，FLO5，FLO9，FLO10，FLO11基因；所述的启动子包括但不局限于PGK和GAL1；所述的表达载体为穿梭载体、游离载体和整合载体中的任意一种，包括但不局限于pRS425。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述宿主细胞为原核微生物和真核微生物中的任意一种，包括但不局限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、微藻类。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述优化...

【专利技术属性】
技术研发人员：李益民，袁文杰，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：