人白细胞介素-5重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种人白细胞介素

【技术实现步骤摘要】
人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物医药制备
，尤其涉及一种人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法。

技术介绍

[0002]人白细胞介素
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5(Interleukin
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5，IL
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5)是1980年由Takasu等人首先发现的一种分泌型细胞因子，它主要由激活的辅助性T细胞2(T helper 2cell，Th2)、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生。人白细胞介素
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5对嗜酸性粒细胞的生长、成熟、分化、活化、迁移起着最主要的作用，并可以通过抑制凋亡延长嗜酸性粒细胞的生存；在单独或与转化生长因子B联合作用的条件下，人白细胞介素
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5可以通过体液免疫应答促进活化的B细胞产生IgA。
[0003]现有的人白细胞介素
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5重组蛋白主要通过昆虫杆状病毒系统与CHO细胞表达系统生产获得，昆虫杆状病毒系统与CHO细胞表达系统的表达周期长，从获得表达质粒到完成蛋白表达需要1个月甚至更长的时间，在上述真核系统中得到的人白细胞介素
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5重组蛋白是完全糖基化的活性蛋白。但是研究表明，真核系统的糖基化过程对人白细胞介素
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5重组蛋白拥有生物活性是非必要的，其生物活性主要是与其C端残基和二聚体结构有关，所以使用原核系统表达也能够得到具有完全生物活性的人白细胞介素
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5重组蛋白。而在现有的使用原核系统进行人白细胞介素
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5重组蛋白表达案例中，普遍通过3
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4种凝胶层析柱纯化才能获得较高纯度的目的蛋白。
[0004]因此，有必要开发一种人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法以解决现有技术中存在的上述问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种人白细胞介素
‑
5重组蛋白的制备方法，解决了现有技术中在原核系统中制备人白细胞介素
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5重组蛋白需采用多步纯化才能得到较高纯度的目的蛋白的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0007]S1：将序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体；
[0008]S2：将所述重组载体转化到大肠杆菌表达系统，经诱导培养后得到含有目的蛋白的菌体；
[0009]S3：将变性裂解液加入所述菌体中，经过破碎离心以得到蛋白溶解液；
[0010]S4：将所述蛋白溶解液经一次柱纯化以得到蛋白洗脱液，其中，所述柱纯化包括变性清洗和变性洗脱；
[0011]S5：将所述蛋白洗脱液在低温条件下缓慢加入复性液中，再进行超滤浓缩和透析以得到序列如SEQ ID NO:2所示的所述目的蛋白，所述目的蛋白为人白细胞介素
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5重组蛋
白。
[0012]本专利技术所述的人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法的有益效果在于：将序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体；将所述重组载体转化到大肠杆菌表达系统，经诱导培养后得到含有目的蛋白的菌体，所述重组载体有利于实现人白细胞介素
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5重组蛋白在大肠杆菌表达系统中的高效表达；将变性裂解液加入所述菌体中，经过破碎离心以得到蛋白溶解液；将所述蛋白溶解液经一次柱纯化以得到蛋白洗脱液，其中，所述柱纯化包括变性清洗和变性洗脱；将所述蛋白洗脱液在低温条件下缓慢加入复性液中，再进行超滤浓缩和透析以得到序列如SEQ ID NO:2所示的所述目的蛋白，所述目的蛋白为人白细胞介素
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5重组蛋白，该方法只需将所述蛋白溶解液经过一次柱纯化和复性后即可得到较高纯度的目的蛋白，本专利技术解决了现有技术中在原核系统中制备人白细胞介素
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5重组蛋白需采用多步纯化才能得到较高纯度的目的蛋白的问题，同时本专利技术的制备方法具有步骤简单、成本低和回收率较高的优点。
[0013]可选的，所述大肠杆菌表达载体包括pET21a(+)。
[0014]可选的，所述步骤S1中，将序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体的步骤包括，使用限制性内切酶分别酶切所述核酸分子和所述pET21a(+)以得到酶切核酸分子和酶切pET21a(+)，将所述酶切核酸分子插入所述酶切pET21a(+)中以得到所述重组载体。
[0015]可选的，所述限制性内切酶为BamHI限制性内切酶和XhoI限制性内切酶。
[0016]可选的，所述转化的方法为化学转化。
[0017]可选的，所述大肠杆菌表达系统包括大肠杆菌宿主菌，所述大肠杆菌宿主菌为BL21(DE3)。
[0018]进一步可选的，所述变性裂解液包括0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6～10摩尔/升的尿素、浓度为4～6毫摩尔/升的咪唑、浓度为0.5～1.5％的聚乙二醇辛基苯基醚和浓度为0.5～1.5毫摩尔/升的苯甲基磺酰氟，所述变性裂解液的pH值为7.5～8.5。其有益效果在于：所述变性裂解液能够将溶液中的所述目的蛋白尽量溶解并防止所述目的蛋白降解，从而提高所述目的蛋白的收率。
[0019]可选的，所述变性清洗的变性清洗液包括浓度为0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6～10摩尔/升的尿素和浓度为30～100毫摩尔/升的咪唑，所述变性清洗液的pH值为7.5～8.5。其有益效果在于：所述变性清洗液能够尽量将其他蛋白清洗掉，柱上只保留所述目的蛋白。
[0020]可选的，所述变性洗脱的变性洗脱液包括浓度为0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6～10摩尔/升的尿素和浓度为400～600毫摩尔/升的咪唑，所述变性洗脱液的pH值为7.5～8.5。其有益效果在于：所述变性洗脱液能够将所述目的蛋白完全洗脱。
[0021]可选的，所述柱纯化中使用的柱子是镍柱。
[0022]可选的，所述低温条件的温度为0～4℃。
[0023]可选的，所述复性液包括浓度为40～60毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.1～0.2摩尔/升的氯化钠、浓度为0.2～0.4摩尔/升的L
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精氨酸、浓度为1.0毫摩尔/升/0.5毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽和浓度为0.5～1.5毫摩尔/升的二硫苏糖醇，所述复性液的pH值为8.5～9.5。其有益效果在于：所述复性液能够保证所述目的蛋
白完成复性并在复性过程中保证所述目的蛋白的稳定性。
[0024]可选的，所述透析的透析液包括浓度为40～60毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、浓度为0.1～0.2摩尔/升的氯化钠和浓度为0～0.2摩尔/升的L
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精氨酸，所述透析液的pH值为8.5～9.5。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体；S2：将所述重组载体转化到大肠杆菌表达系统，经诱导培养后得到含有目的蛋白的菌体；S3：将变性裂解液加入所述菌体中，经过破碎离心以得到蛋白溶解液；S4：将所述蛋白溶解液经一次柱纯化以得到蛋白洗脱液，其中，所述柱纯化包括变性清洗和变性洗脱；S5：将所述蛋白洗脱液在低温条件下缓慢加入复性液中，再进行超滤浓缩和透析以得到序列如SEQ ID NO:2所示的所述目的蛋白，所述目的蛋白为人白细胞介素
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5重组蛋白。2.根据权利要求1所述的人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体包括pET21a(+)。3.根据权利要求2所述的人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，将序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子插入大肠杆菌表达载体以得到重组载体的步骤包括，使用限制性内切酶分别酶切所述核酸分子和所述pET21a(+)以得到酶切核酸分子和酶切pET21a(+)，将所述酶切核酸分子插入所述酶切pET21a(+)中以得到所述重组载体。4.根据权利要求3所述的人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为BamHI限制性内切酶和XhoI限制性内切酶。5.根据权利要求1所述的人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述转化的方法为化学转化。6.根据权利要求1所述的人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌表达系统包括大肠杆菌宿主菌，所述大肠杆菌宿主菌为BL21(DE3)。7.根据权利要求1所述的人白细胞介素
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5重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述变性裂解液包括浓度为0.005～0.015摩尔/升的磷酸盐缓冲液、浓度为6...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐陈槐，陈扬，潘兴鑫，周延庆，丁雯雯，
申请(专利权)人：杭州赛基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：