连续克隆长DNA片段的方法和系统技术方案

本发明专利技术提供用于构建长DNA片段的多核苷酸、核酸构建物、方法和系统，所述多核苷酸包含：双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点。起点。

【技术实现步骤摘要】
连续克隆长DNA片段的方法和系统


[0001]本专利技术涉及DNA克隆领域，具体涉及长DNA片段的连续克隆的方法和系统。

技术介绍

[0002]全基因组测序信息表明不同生物基因组的大小差异很大，简单和低等的生物基因组相对较小，比如细菌基因组有1
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10Mb，酵母基因组为12Mb，随着生物进化得越来越复杂，生物的基因组也变得越来越大，比如植物拟南芥基因组有120Mb，昆虫果蝇基因组有137Mb，小鼠基因组有2.6Gb，而人的基因组有3.0Gb。随着人类对生命科学探索的不断深入，人工合成生物基因组工作正在全球多个国家有序展开，我们对于基因组超大DNA片段的快速精准组装的需求日益迫切。此外，在复杂高等生物基因组中，功能相同或相关的基因常常聚集在一起，形成超大的功能基因簇，大小可达1Mb。而超大的DNA片段在操作过程中存在随机断裂、易降解、难以转移、耗时长等缺陷。发展超大DNA片段(≥1Mb)操作技术对人工生命体的创建以及复杂高等生物基因组功能的研究及应用都至关重要。
[0003]但是，目前已发展的经典分子生物学常用的克隆载体不能满足克隆基因组超大DNA片段的需求。比如来源于小质粒、噬菌体和粘粒的克隆载体通常只能容纳<40kb的外源DNA片段。细菌人工染色体(BAC)系统是一种常用的细菌克隆系统，常用于克隆100
‑
300kb的DNA片段。BAC载体来自于大肠杆菌的单拷贝质粒F因子，且在宿主体内遗传复制稳定，使细菌人工染色体系统广泛应用于基因组文库构建。但是，传统的BAC克隆是一种环型形式的DNA，较大的环型DNA难以与大肠杆菌环型基因组分离、检测及纯化。酵母人工染色体(YAC)是酵母中常用来高等生物基因组文库的载体。虽然酵母人工染色体能够容纳大于1Mb的外源DNA片段，但长重复序列的DNA片段在宿主体内不稳定的，不稳定的YAC载体克隆会引发外源片段的重组丢失。另外，由于共连接或重组，YAC文库存在20
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60％的嵌合体克隆，即包含多于2个非连续片段基因组区段，这极大限制了酵母人工染色体的应用。
[0004]大肠杆菌是最常用的遗产操作宿主，它比酵母生长更快，而且遗产操作也更容易。本专利技术仍需发展在大肠杆菌中连续克隆基因组超大片段DNA的新方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术涉及新的克隆超大片段DNA的线型载体，并利用新载体建立了超大DNA片段的体内连续克隆拼接的新方法。利用本专利技术实现低成本短时间高效迭代无缝拼接组装出大于1Mb的超大DNA片段。
[0006]本专利技术第一方面提供一种多核苷酸，用于构建长DNA片段，所述多核苷酸包含：双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点。
[0007]在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸还包含5
’
同源臂和3
’
同源臂。所述同源臂用于借助基因编辑系统使所述多核苷酸与目的片段整合(成环形)。
[0008]在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸还包括借助基因编辑系统通过5
’
同源臂和3
’
同源臂整合的目的片段。
[0009]在一个或多个实施方案中，所述5
’
同源臂和3
’
同源臂分别识别目的片段的3
’
端和5
’
端。
[0010]在一个或多个实施方案中，所述基因编辑系统选自CRISPR、ZFN、TALEN。
[0011]在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点，转移起始位点oriT和复制起点位于5
’
同源臂和3
’
同源臂之间。
[0012]在一个或多个实施方案中，5
’
同源臂长度为30
‑
1000bp、50
‑
900bp、100
‑
800bp、200
‑
700bp、300
‑
600bp、400
‑
500bp。
[0013]在一个或多个实施方案中，3
’
同源臂长度为30
‑
1000bp、50
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900bp、100
‑
800bp、200
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700bp、300
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600bp、400
‑
500bp。
[0014]在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点或其互补序列能被其切割酶切割。
[0015]在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点是tos位点。
[0016]在一个或多个实施方案中，tos位点来源于噬菌体N15。
[0017]在一个或多个实施方案中，tos位点序列包含SEQ ID NO:1所示的序列或其互补序列。
[0018]在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，例如大肠杆菌。
[0019]在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT来源于大肠杆菌BAC。
[0020]在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT来源于质粒pQX17。
[0021]在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT包含SEQ ID NO:2所示的序列。
[0022]在一个或多个实施方案中，复制起点来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌。
[0023]在一个或多个实施方案中，复制起点来源于大肠杆菌。
[0024]在一个或多个实施方案中，复制起点包含SEQ ID NO:3或4所示的序列。
[0025]在一个或多个实施方案中，转移起始位点oriT和复制起点的位置可互换。
[0026]在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点位于转移起始位点oriT和复制起点的5
’
端或3
’
端。
[0027]在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点位于转移起始位点oriT和复制起点之间。
[0028]在一个或多个实施方案中，双链切割识别位点位于复制起点的5
’
端。此时切割和重组效率高于双链切割识别位点位于复制起点的3
’
端的情况。
[0029]在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸依次包含：
[0030]5’
同源臂，复制起点，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，3
’
同源臂；
[0031]5’
同源臂，转移起始位点oriT，复制起点，双链切割识别位点，3
’
同源臂；
[0032]5’
同源臂，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，复制起点，3
’
同源臂；
[0033]5’
同源臂，复制起点，双链切割识别位点，转移起始位点oriT，3
’
同源臂；
[0034]5’
同源臂，双链切割识别位点，转移起始位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多核苷酸，用于构建长DNA片段，所述多核苷酸包含：双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点，双链切割识别位点或其互补序列能被切割酶切割，优选地，所述多核苷酸还包含用于整合目的片段的5
’
同源臂和3
’
同源臂，所述目的片段是所述长DNA片段的一部分；更优选地，所述双链切割识别位点、转移起始位点oriT和复制起点位于5
’
同源臂和3
’
同源臂之间。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述双链切割识别位点是tos位点，所述切割酶是TelN，优选地，tos位点来源于噬菌体N15，和/或转移起始位点oriT来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，和/或复制起点来源于肠杆菌科细菌，优选埃希氏菌属细菌，和/或所述多核苷酸还包含标记基因，和/或转移起始位点oriT和复制起点的位置可互换；更优选地，tos位点序列包含SEQ ID NO:1所示的序列或其互补序列，和/或转移起始位点oriT包含SEQ ID NO:2所示的序列，和/或复制起点包含SEQ ID NO:3或4所示的序列，和/或标记基因位于5
’
同源臂和3
’
同源臂之间，和/或标记基因位于转移起始位点oriT和复制起点之间，和/或标记基因位于复制起点的3
’
端，和/或双链切割识别位点位于复制起点的5
’
端。3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸依次包含：5
’
同源臂，复制起点，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，3
’
同源臂；5
’
同源臂，转移起始位点oriT，复制起点，双链切割识别位点，3
’
同源臂；5
’
同源臂，转移起始位点oriT，双链切割识别位点，复制起点，3
’
同源臂；5
’
同源臂，复制起点，双链切割识别位点，转移起始位点oriT，3
’
同源臂；5
’
同源臂，双链切割识别位点，转移起始位点oriT，复制起点，3
’
同源臂；或5
’
同源臂，双链切割识别位点，复制起点，转移起始位点oriT，3
’
同源臂。4.一种核酸构建物，包含权利要求1
‑
3中任一项所述的多核苷酸和目的片段，用于构建长DNA片段，优选地，所述目的片段是长DNA片段的一部分，和/或所述长DNA片段的长度至少2kb，和/或所述目的片段的长度为至少1kb，和/或所述核酸构建物是环形构建物，或所述核酸构建物是线性构建物并且其中双链切割识别位点或其互补序列被切割酶切割。5.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物包含：(1)第一核酸构建物，其具有权利要求1
‑
3中任一项所述的多核苷酸和第一目的片段，(2)第二核酸构建物，其具有权利要求1
‑
3中任一项所述的多核苷酸和第二目的片段，其中第一目的片段的3
’
端
与第二目的片段的5
’
端具有1kb
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：覃重军，鲁宁，薛小莉，钟莉，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：