基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法及其应用，具体包括构建重组表达质粒、构建重组菌株并表征、构建重组质粒系统的步骤；基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球的应用方式为将由PHA合成酶的功能化微球制成的PHA合成酶的功能化微球用于催化托伐普坦前手性酮合成S型托伐普坦。本发明专利技术的PHA微球自组装多酶复合体具有稳定性高、可重复利用的优点。用的优点。用的优点。

【技术实现步骤摘要】
基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，更具体涉及一种基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]酶作为高效生物催化剂，具备底物特异性好、温和的反应条件和快速的反应速度，在许多领域得到了广泛的应用，如化工制造、食品生产、环境、医药等行业。
[0003]多数天然酶难以进行大规模的生产制备，投入反应后无法回收再利用并且为后续工艺的纯化除杂造成困难，酶相较传统工业催化剂稳定性较差、对环境变化的敏感度高。为了改善酶的稳定性，使其在工业生产中能够连续使用，将酶负载于固相载体的固定化酶技术得到广泛关注。
[0004]传统的酶固定化方法主要有吸附法、共价结合法、包埋法、交联法等。包埋法固定化酶的固定过程中，酶本身不受化学反应的影响，能保证酶本身的反应活性在固定化酶制备过程中损失较小并且使用过程中酶不易脱落，但是酶被包裹在固相载体内导致酶与底物的结合范围变小，一定程度上影响了酶活性的发挥。吸附法是目前使用广泛的固定化酶的方法，采用吸附法对酶进行固定化操作简便、固定化过程温和、成本低，但酶与固相载体间结合不牢固极易在使用过程中脱落。交联法及共价结合法将酶与固相载体通过共价键结合，结合牢固但结合过程中的反应条件较为剧烈，会对酶活造成较大的损失。传统的固定化酶手段需要将酶分离提纯后再与制备好的固相载体进行结合，过程复杂，同样限制了固定化酶大规模工业化应用。
[0005]与传统的固定化酶方式对比，模拟天然多酶复合体，在胞外人工构建多酶分子机器有着诸多优点。由微生物产生的聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoat e，PHA)微球，就是一个天然的多酶自组装复合体。其内部是由疏水聚酯链构成的疏水核心，外层是由磷脂界膜及膜上嵌入或附着的包括PHA合酶(Polyest er synthase，PhaC)、PHA颗粒结合蛋白(Granule associated protein，PhaP)、PHA合成调控蛋白(Regulator protein，PhaR)和NADPH依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶(NADPH dependent acetyl
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CoA reductase，PhaB)等构成的多酶边界层。PhaC通过共价键连接在PHA微球表面，而PhaP通过疏水相互作用吸附在PHA微球表面。通过将外源性功能蛋白元件与PhaC或PhaP进行融合表达，在重组微生物体内就能直接合成表面带有功能蛋白的微球复合体。通过调控PhaP基因的表达，即可获得不同颗粒大小、不同载量酶元件的PHA微球。该微球通过细胞破碎及离心等方法就能简便、有效地从细胞中分离并得以纯化，有望成为多酶组装的一种经济高效的替代方法。
[0006]目前，已有应用该PHA微球承载各种单酶进行组装的报道，如新西兰Rehm课题组分别将脂肪酶B、β
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半乳糖苷酶、α
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淀粉酶或碳酸酐酶与PHA合成酶进行融合表达，在重组大肠杆菌中生产出具有酶活的PHA固定化单酶的微球。但是尚无PHA微球胞内固定化多酶，并将其应用于体外级联催化方面的报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术需要解决的技术问题是提供一种基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法及其应用，以解决不能PHA微球胞内固定化多酶的问题，以实现PHA微球的多酶组装。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。
[0009]一种基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法，以Bacillus cereus HBL
‑
AI中的PhaA、PhaB、PhaR，PhaC和PhaP基因为起点开始构建，其特征在于，具体包括以下步骤：
[0010]S1、构建合成PHA微球的重组表达质粒：构建重组质粒pACYCDuet
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1 P1 C.n phaAB P2 B.c phaRC、重组质粒pACYCDuet
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1 P1 C.n phaAB P2 B.c phaRC
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egfp、重组质粒Pet28a
‑
phap
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mCherry；
[0011]S2、构建重组菌株并表征：利用S1中制备的重组质粒构建胞内合成PHA微球的重组菌株，并通过共聚焦和电镜对合成的PHA微球进行表征；
[0012]S3、构建PHA微球自组装羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组质粒系统。
[0013]进一步优化技术方案，所述S1中构建重组质粒pACYCDuet
‑
1 P1 C.nphaAB P2 B.cphaRC的方法为：将来源于Bacillus cereus HBL
‑
AI的phaAB和phaRC基因簇分别插入载体pACYCDuet
‑
1的MCS
‑
1、MCS
‑
2。
[0014]进一步优化技术方案，所述基因簇的插入方式为Overlap PCR组装。
[0015]进一步优化技术方案，所述载体pACYCDuet
‑
1包含2个多克隆位点MCS
‑
1、MCS
‑
2，每个位点前面都有1个T7启动子和lac操纵子以及核糖体结合位点。
[0016]进一步优化技术方案，所述S1中构建重组质粒pACYCDuet
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1 P1 C.nphaAB P2 B.cphaRC
‑
egfp的方法为：以pACYCDuet
‑
1 P1 C.nphaAB P2 B.cphaRC为PCR模板扩增phaRC，以pET
‑
28a(+)&egfp为PCR模板扩增egfp，通过引物引入Linker(3*G4S)，使用Overlap PCR拼装片段phaRC
‑
egfp，酶切后连接至pACYCDuet
‑
1 P1 C.nphaAB的MCS
‑
2。
[0017]进一步优化技术方案，所述S1中构建重组质粒Pet28a
‑
phap
‑
mCherry的方法为：利用引物PCR分别扩增Bacillus cereus HBL
‑
AI的phaP基因和pET28a
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mCherry质粒的mCherry基因，然后采用Overlap PCR将目标片段插入到载体pET28a的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点处。
[0018]进一步优化技术方案，所述S2中合成PHA微球的重组菌株的过程为：将相同体积的pACYCDuet
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1 P1 C.n phaAB P2 B.c phaRC
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egfp和pET28a
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phap
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mCherry同时加入到BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴、热激、冰浴；随本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法，该方法以Bacillus cereus HBL
‑
AI中的PhaA、PhaB、PhaR，PhaC和PhaP基因为起点开始构建，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、构建合成PHA微球的重组表达质粒：构建重组质粒pACYCDuet
‑
1 P1 C.n phaAB P2 B.c phaRC、重组质粒pACYCDuet
‑
1 P1 C.n phaAB P2 B.c phaRC
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egfp、重组质粒Pet28a
‑
phap
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mCherry；S2、构建重组菌株并表征：利用S1中制备的重组质粒构建胞内合成PHA微球的重组菌株，并通过共聚焦和电镜对合成的PHA微球进行表征；S3、构建PHA微球自组装羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组质粒系统。2.根据权利要求1所述的基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法，其特征在于，所述S1中构建重组质粒pACYCDuet
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1 P1 C.nphaAB P2 B.c phaRC的方法为：将来源于Bacillus cereus HBL
‑
AI的phaAB和phaRC基因簇分别插入载体pACYCDuet
‑
1的MCS
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1、MCS
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2。3.根据权利要求2所述的基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法，其特征在于：所述基因簇的插入方式为Overlap PCR组装。4.根据权利要求2所述的基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法，其特征在于：所述载体pACYCDuet
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1包含2个多克隆位点MCS
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1、MCS
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2，每个位点前面都有1个T7启动子和lac操纵子以及核糖体结合位点。5.根据权利要求1所述的基于芽孢杆菌PHA合成酶的功能化微球构建方法，其特征在于，所述S1中构建重组质粒pACYCDuet
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1 P1 C.n phaAB P2 B.c phaRC
‑
egfp的方法为：以pACYCDuet
‑
1 P1 C.n phaAB P2 B.c phaRC为PC R模板扩增phaRC，以pET
‑
28a(+)&egfp为PCR模板扩增egfp，通过引物引入Linker(3*G4S)，使用Overlap PCR拼装片段phaRC
‑
egfp，酶切后连接至pACYC Duet
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩孟楠，傅双庆，刘德旭，范雪雨，李馨月，郭振鹏，张红蕾，李玮，
申请(专利权)人：韩孟楠，
类型：发明
国别省市：